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Nov 14, 2023

Nuevos conocimientos sobre el cultivo en raceway de Euglena gracilis bajo condiciones prolongadas

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7123 (2023) Citar este artículo

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Este estudio tuvo como objetivo investigar las respuestas fisiológicas de Euglena gracilis (E. gracilis) cuando se somete a una privación semicontinua de N (N-) durante un período prolongado en estanques abiertos. Los resultados indicaron que las tasas de crecimiento de E. gracilis bajo la condición de N- (11 ± 3,3 gm-2 d-1) fueron un 23 % más altas en comparación con las de N-suficiente (N+, 8,9 ± 2,8 gm-2 d-1). ) condición. Además, el contenido de paramylon de E. gracilis estaba por encima del 40 % (p/p) de biomasa seca en la condición N- en comparación con la condición N+ (7 %). Curiosamente, E. gracilis exhibió números de células similares independientemente de las concentraciones de nitrógeno después de un cierto punto de tiempo. Además, demostró un tamaño de celda relativamente más pequeño a lo largo del tiempo y un aparato fotosintético no afectado en condiciones N-. Estos hallazgos sugieren que existe una compensación entre el crecimiento celular y la fotosíntesis en E. gracilis, ya que se adapta a condiciones semicontinuas de N- sin una disminución en su tasa de crecimiento y productividad de paramylon. En particular, según el conocimiento del autor, este es el único estudio que informa una alta acumulación de biomasa y producto por una cepa de E. gracilis de tipo salvaje en condiciones de N-. Esta capacidad de adaptación a largo plazo recientemente identificada de E. gracilis puede ofrecer una dirección prometedora para que la industria de las algas logre una alta productividad sin depender de organismos modificados genéticamente.

Euglena gracilis es un alga móvil unicelular de agua dulce que pertenece a la familia de los protistas. Desde su descubrimiento en 1660s1, ha recibido una atención considerable. E.gracilis es un organismo modelo importante para comprender los mecanismos fotosintéticos y los procesos celulares eucariotas, debido a sus propiedades únicas de organización de plástidos y cloroplastos2,3. En condiciones de luz aeróbica, E. gracilis realiza la fotosíntesis y almacena su energía en forma de un polisacárido de almacenamiento, β-1-3-glucano no ramificado conocido como paramylon3,4. En condiciones de oscuridad anaeróbica, E. gracilis convierte el paramylon en ésteres de cera. Son lípidos monocatenarios compuestos por ácidos grasos saturados (ácido mirístico C14:0, ácido palmítico C16:0 y ácido esteárico C18:0) y alcoholes (alcohol miristílico)4. Las aplicaciones de E. gracilis y sus bioproductos (paramylon y ésteres de cera) se encuentran en diversos campos como la fibra dietética, el tratamiento de la diabetes, la mejora de la microbiota intestinal, los complementos alimenticios y los biocombustibles5,6,7. Dada su amplia gama de aplicaciones, E. gracilis se ha establecido como una microalga industrial prometedora. Varias industrias basadas en algas lo utilizan para la producción a gran escala de alimentos, productos para el cuidado de la salud y biocombustibles3.

La industria de las algas enfrenta el desafío persistente de lograr una alta productividad de biomasa y bioproductos con bajos costos operativos. Si bien existen beneficios potenciales de las algas en campos como la producción de biocombustibles, el tratamiento de aguas residuales, la captura de carbono y la mitigación del cambio climático, su productividad sigue siendo una barrera de larga data para la industria8,9,10. Aunque la modulación de las condiciones ambientales y los nutrientes puede mejorar la formación de bioproductos, a menudo resulta en una disminución de la productividad de la biomasa7. En el caso de E. gracilis, el paramylon se considera un bioproducto valioso. Su acumulación se ha observado en diversas condiciones, como falta de nutrientes, alta salinidad, estimulación eléctrica, cocultivo con bacterias y cultivo heterótrofo5,11,12,13,14,15,16. Los investigadores también han intentado la modificación genética para mejorar la productividad y el contenido de paramylon en E. gracilis17,18. A pesar de tales esfuerzos para mejorar la producción de biomasa y bioproductos, siempre hay un alto precio que pagar en términos de tecnología o impacto ambiental.

La privación o limitación de nitrógeno (N−) es un tratamiento rentable y seguro para inducir la acumulación de bioproductos en E. gracilis19. El tratamiento desencadena cambios metabólicos que mejoran la recirculación de carbono (fijado fotosintéticamente) de las proteínas a componentes de almacenamiento como lípidos o almidón, lo que da como resultado un mecanismo de almacenamiento de energía20,21,22. Sin embargo, la productividad de la biomasa generalmente se reduce en condiciones de N- en comparación con las condiciones de control22,23,24. Se han realizado varios estudios de tratamiento con nitrógeno, como la adición intermedia, la privación de nitrógeno en dos etapas, semicontinua y secuencial para mejorar la productividad de la biomasa y los lípidos25,26,27,28,29. No obstante, este tema requiere ser dilucidado más. Un estudio reciente sobre Chlorella que utilizó una privación de nitrógeno en dos etapas en cultivos por lotes demostró ser una forma eficiente de mantener una alta biomasa rica en lípidos29. Solo se han realizado unos pocos estudios sobre E. gracilis, que revelaron que la productividad de la biomasa del organismo disminuye en condiciones de limitación de N29,30,31,32. Solo unos pocos estudios sobre cepas genéticamente modificadas lograron lograr tanto una alta biomasa como una acumulación de bioproductos en condiciones de limitación de N17,33. Sin embargo, se necesita más investigación para mejorar la eficiencia de la estrategia de tratamiento con nitrógeno para lograr una alta productividad de biomasa y bioproducto simultáneamente.

Actualmente, se sabe muy poco sobre cómo E. gracilis responde a las condiciones semicontinuas de N-, especialmente durante períodos prolongados. Además, no ha habido informes de tales estudios realizados en entornos naturales utilizando E. gracilis. Dada la importancia de E. gracilis en la industria, es crucial para lograr un cultivo semicontinuo estable y de alta productividad34. A la luz de esto, nuestro estudio tuvo como objetivo investigar el crecimiento y la acumulación del bioproducto paramylon en E. gracilis en condiciones de N- semicontinuas utilizando canales abiertos (Fig. 1a, b). Los hallazgos de este estudio podrían ser valiosos para evaluar la viabilidad de utilizar el cultivo semicontinuo de N como método para cultivar E. gracilis para la producción comercial a gran escala.

Sistema de cultivo de 1 m2 utilizado en este estudio. (a) Configuración del estanque Raceway que muestra los estanques R11 a R16. R11, R14 y R15 se mantuvieron en control (N-suficiente, N +) y R12, R13 y R16 se mantuvieron en condiciones de falta de N (N-). Aquí, l, d y w de la regla representan la longitud, el ancho y la altura del estanque (en milímetros, mm) dentro de la pared del estanque. La imagen fue tomada el día 1 de cultivo. (b) Una vista comparativa de los cultivos N+ y N− en los estanques raceway. Las imágenes fueron tomadas el día 5 del experimento.

Los cultivos se mantuvieron con éxito durante 16 semanas sin la adición de nuevos cultivos de semillas durante el período de cultivo de cuatro meses. Los experimentos se llevaron a cabo semanalmente durante 5 días para la condición de N- con disponibilidad de nitrógeno durante dos días, seguido de privación de N durante tres días. En la condición N+, hasta el 20-60% del nitrógeno inicial se consumió el día 5 (Fig. 2, Fig. 1A complementaria). En los estanques de N- (R12, R13 y R16), el nitrógeno se consumió por completo el día 3 y los cultivos se mantuvieron bajo N- hasta el día 5 (Fig. 1A complementaria). Parece que la cantidad de consumo de N también varía debido a otros parámetros ambientales. La temperatura y la radiación solar variaron con el tiempo a medida que avanzaba el experimento hacia el final de las 16 semanas. Se observó una disminución en la radiación solar promedio y la temperatura durante los días lluviosos y el inicio del invierno (Fig. 2). Esto también se reflejó en los datos de correlación del consumo de nitrógeno (Figura complementaria 1B). La utilización de N mostró una correlación positiva moderada entre la radiación solar (r = 0,3) y la temperatura (r = 0,4). Adicionalmente, también se observó una correlación positiva moderada entre la radiación solar y la temperatura, mientras que se correlacionaron negativamente con el tiempo.

Contenido medio de N de la condición de N suficiente (N +), temperatura diaria y radiación solar. Las líneas negra, gris y discontinua representan la radiación solar (MJ m-2 día-1), la temperatura promedio diaria (°C) y el contenido de N (mg L-1) de los estanques de N+, respectivamente.

La tasa de crecimiento en la condición N- fue mayor (23%) que en la condición N+ (Fig. 3a). Las tasas de crecimiento promedio semanales oscilaron entre 10 y 14 gm-2 d-1 en la condición N- y entre 6 y 12 gm-2 d-1 en la condición N+. La tasa de crecimiento promedio para el cultivo semanal a lo largo del experimento en condiciones N+ y N− fue de 8,9 ± 2,8 gm−2 d−1 y 11 ± 3,3 gm−2 d−1, respectivamente. Del análisis estadístico, los datos de la tasa de crecimiento del día 1 no indican una diferencia significativa, y el valor p tiende a disminuir con el tiempo desde el día 1 (G-DF: marco de datos de crecimiento, G-DF1) hacia el día 4 (G -DF2) (Tabla 1, Fig. 2A complementaria). Se puede observar una diferencia significativa en las tasas de crecimiento el día 5 (G-DF3) entre las dos condiciones (Tabla 1, Fig. 2B complementaria). Hubo diferencias claras en el rendimiento del crecimiento entre las condiciones (Fig. 3A, B complementarias). En el transcurso de 4 meses, el recuento de células en la condición N+ fue inicialmente mayor que el de la condición N-, pero la diferencia disminuyó gradualmente con el tiempo. En la semana 10, el recuento de células en ambas condiciones parecía ser similar (Fig. 3b, Fig. 4A complementaria).

Características de crecimiento de E. gracilis bajo N-suficiente (N +) y N-inanición (N-). (a) Comparación de las tasas de crecimiento promedio semanal entre N+ y N−. (b) número de células y (c) diámetro de las células al final de cada semana del experimento N− semicontinuo semanal. Los círculos vacíos indican células cultivadas en condiciones N− y los círculos llenos indican células cultivadas en condiciones N+. Los asteriscos negros indican épocas de baja tasa de crecimiento. Los asteriscos rojos indican semanas en las que no se midieron el número de células, el diámetro y el paramilón. Las barras de error para cada medición indican la desviación estándar de los valores medios para cada tratamiento (N+ y N-) en tres estanques (n = 3).

El diámetro de la celda, por otro lado, fue significativamente diferente en el marco de datos de diámetro D-DF2 y D-DF3 (Tabla 1). El diámetro de la celda en la condición N- fue similar a N + en las primeras semanas, y luego pareció ser más pequeño que las células N + (Fig. 3c, Fig. 4B complementaria). El patrón de cambios en el diámetro celular pareció variar del día 3 al 5 de cada experimento semanal (Fig. 4B complementaria). El diámetro de las células cultivadas en ambas condiciones (N+ y N–) se correlacionó positivamente entre sí (r = 0,7) y con el tiempo (r = 0,3 y r = 0,0, respectivamente) a medida que avanzaba semana a semana en el 14- experimento de semana (Fig. 4C complementaria). Además, el diámetro de la celda de las condiciones N+ y N− se correlaciona negativamente con la temperatura (r = − 0,4 y r = − 0,1, respectivamente) y el tiempo a medida que avanza día a día dentro de un experimento semanal (r = − 0,2 y r = − 0.1, respectivamente) (Fig. 4C complementaria).

Los resultados generales indican que el diámetro de la celda en condiciones N− se redujo ligeramente en comparación con las semanas iniciales y fue comparativamente más pequeño que el diámetro de la celda N+. Sin embargo, el número de células promedio (0,6 ± 0,1 × 106 para N+, 0,6 ± 0,0 × 106 células mL−1 para N–) y el diámetro (14,2 ± 0,7 µm para N+, 13,8 ± 0,6 µm para N–) a lo largo del experimento fueron más alto en la condición N + que en la condición N− (Fig. 4D complementaria). Se observó una reducción similar en el crecimiento de E. gracilis en ambas condiciones cuando la radiación solar y la temperatura eran bajas (Fig. 2).

El estudio evaluó la fluorescencia de la clorofila (Chl) y la eficiencia fotosintética en respuesta a la disponibilidad de nitrógeno. Los resultados mostraron que el contenido total de clorofila (Chl a + b) fue ligeramente más bajo en condiciones de N- en comparación con las condiciones de N+ (Figs. 1b, 4a). Sin embargo, la composición de la clorofila-a (Chl-a) y el patrón de respuesta Qy antes y después de la incubación en la oscuridad fueron similares en ambas condiciones (Fig. 4b-d). Además, el análisis ANOVA para las cuatro mediciones no indicó ninguna diferencia significativa (p > 0,05) entre las dos condiciones.

Clorofila y actividad fotosintética de E. gracilis cultivada en condiciones de suficiente N (N +) y falta de N (N-). (a) Contenido total de clorofila (Chl) (Chl a + b) medido durante la última semana (Semana 16) de cultivo. (b) Porcentaje (%) de clorofila-a (Chl-a) presente en el contenido total de clorofila. Rendimiento cuántico fotosintético (Qy) medido antes (c) y (d) después de 1 h de incubación oscura. Los círculos en blanco representan la condición N− y los círculos llenos representan la condición N+. Las barras de error indican la desviación estándar de los valores medios para cada tratamiento (N+ y N−) en tres estanques (n = 3).

Los resultados mostraron que el contenido de paramilón fue mayor en la condición N- en comparación con la condición N+ (Fig. 5a). La acumulación de paramilón osciló entre el 21,0 y el 55,0 % del peso de las células secas en la condición N-, mientras que en la condición N+ se observó que estaba entre el 5,0 y el 10,0 %. En promedio, se acumuló 41,0 ± 13,5 % (328,8 ± 182,9 pg célula−1) de paramilón en condiciones N−, mientras que solo se acumuló 7,7 ± 3,0 % (49,7 ± 23,3 pg célula−1) en condiciones N+. La acumulación de paramylon también se observó bajo microscopía como pequeños cuerpos granulares en las células (Fig. 5b).

Paramylon y composición elemental de partículas. ( a ) Porcentaje del contenido total de carbohidratos representado como % de paramilón (% p/p de biomasa seca) en E. gracilis cultivada en condiciones de suficiente N (N +) y falta de N (N-). El contenido de paramilón se midió el último día de cada semana del experimento de cultivo semicontinuo, excepto la semana 6. Las barras de error indican la desviación estándar de los valores medios del contenido de paramilón para cada tratamiento (N+ y N−) en tres estanques ( n = 3). (b) Microscopía de E. gracilis cultivada en condiciones N+ y N− en campos claros y oscuros. Los cuerpos de Paramylon se pueden ver como pequeños cuerpos ovalados transparentes o rojos en campos claros y oscuros, respectivamente. (c) Porcentaje de carbono orgánico total (TOC) y nitrógeno (TN) medido como un promedio de tres muestras semanales tomadas de un estanque para cada tratamiento (N+ y N−) el último día de cada una de las tres semanas. Las barras de error indican la desviación estándar de los valores medios de las mediciones de TOC y TN para cada tratamiento durante el período de tres semanas (n = 3). Las barras grises indican la condición N- y las barras negras indican la condición N+.

También se encontró que los contenidos de nitrógeno total (TN) y carbono total (TC) diferían entre las condiciones N- y N+ (Fig. 5c). En el día 5, se observó un mayor contenido de nitrógeno en las células bajo la condición N+ (10,0 ± 0,5 %) en comparación con la condición N− (5,3 ± 1,2 %). Por el contrario, el contenido promedio de N en el medio libre de células el día 5 estuvo por debajo del nivel de detección alrededor de 0 mg L-1 en la condición N- y 44,8 ± 13,6 mg L-1 en la condición N+, lo que indica una proporción más alta. de nitrógeno en la celda al medio en N- en comparación con la condición N+.

Al final del experimento semanal, se encontró que casi el 48,0 ± 2,0 % de carbono estaba presente en las células N+, mientras que el 46,0 ± 2,0 % estaba presente en las células N−. El contenido de carbono total por celda fue de 0,4 ± 0,1 ng celda-1 en la condición N- y 0,3 ± 0,0 ng celda-1 en la condición N+. En general, los resultados sugieren que la disponibilidad de nitrógeno afecta la acumulación de paramylon y la composición de las partículas en las células.

En este estudio, observamos una tasa de crecimiento un 23 % mayor en la condición N− en comparación con la condición N+, lo que no puede explicarse únicamente por las diferencias en la fijación de carbono. Las respuestas celulares variaron con el tiempo. Quedó claro a partir de los resultados que durante los primeros tres días del experimento, las células en ambas condiciones crecían activamente en condiciones de N suficiente, con concentraciones iniciales de biomasa similares en todos los tanques. Por lo tanto, no se observaron diferencias significativas en las pruebas G-DF1 y G-DF2. Sin embargo, la tasa de crecimiento para todos los días (G-DF3) mostró un marcado contraste entre las condiciones N+ y N− con un valor de p inferior a 0,05, lo que indica una mayor tasa de crecimiento en las condiciones N−. El tamaño de celda promedio en la condición N- también fue más pequeño que en la condición N+, lo que se reflejó en las pruebas D-DF2 y D-DF3 con un valor de p inferior a 0,05. La tendencia en el tamaño de las celdas es consistente con informes previos en otros géneros de algas Scenedesmus y Rhodomonas, así como especies como Ankistrodesmus falcatus y Stephanodiscus minululus19,35. Curiosamente, el análisis de correlación mostró que la reducción del tamaño de las células se produjo tanto en condiciones N+ como N- durante períodos cortos de cultivo, pero pareció ser más pronunciada en condiciones N-. Además, en períodos de cultivo prolongados, el tamaño y la cantidad de células pueden verse afectados por factores ambientales más allá de la disponibilidad de nitrógeno, como la temperatura. En el estudio actual, se encontró que las temperaturas ambientales bajas disminuyen la tasa de crecimiento y aumentan el volumen celular en ambas condiciones. Nuestros resultados son consistentes con estudios previos que indican la preferencia de E. gracilis por el crecimiento protoplásmico a bajas temperaturas y la división celular a altas temperaturas36. Sin embargo, el impacto de la temperatura en el tamaño de la celda en condiciones de N- parece ser mínimo y no se ha informado previamente. E. gracilis en condición N- inicialmente mostró un menor número de células y un diámetro similar en comparación con la condición N+, mientras que después de algunas semanas se observó un mayor número de células con un diámetro más pequeño, lo que sugiere que el cultivo prolongado en condiciones semicontinuas de N- modula la fisiología de E. gracilis. En condiciones de N−, E. gracilis tuvo que adaptarse al entorno en el que la disponibilidad de nitrógeno varía drásticamente en poco tiempo. Las células crecen rápidamente inicialmente debido a un suministro suficiente de N durante 4 días antes de la inanición de N de 3 días, pero luego experimentaron cambios bioquímicos para almacenar energía29. Parece que E. gracilis es capaz de aclimatarse al proceso cíclico de adquisición de N en condiciones N-, lo que da como resultado una tasa de crecimiento más alta en comparación con la condición N+. Dado que el cultivo se realizó en un estanque abierto, las condiciones ambientales en los cultivos N+ y N− fueron similares, las diferencias observadas en el crecimiento y la biomasa se debieron en gran medida a la disponibilidad de nitrógeno.

En condiciones de N−, un tamaño de célula más pequeño puede sugerir un contenido de proteína más bajo19, y la reserva de carbono se dirige hacia la síntesis de carbohidratos o lípidos23,24,25. En nuestro estudio, observamos un alto contenido de paramilón (> 40 %) en condiciones de N−, lo que indica que el carbono se fija en el paramilón para la conservación de energía, lo que da como resultado un aumento en la densidad celular. Por otro lado, E. gracilis en condiciones N+ utiliza el carbono fijo para generar energía para la división celular, lo que da como resultado un número alto de células pero una densidad celular baja. Esto es evidente a partir de las diferencias en el número de células y la biomasa entre las dos condiciones durante las semanas iniciales. Sin embargo, con el tiempo, el número de células fue similar en ambas condiciones, mientras que la biomasa se mantuvo más alta en las condiciones de N-. Esto respalda aún más la idea de la aclimatación de E. gracilis, lo que le permite crecer mientras acumula paramylon utilizando el carbono fijo.

Además, los resultados actuales muestran que el contenido de carbono por celda fue casi 1,5 veces mayor en condiciones N- (0,42 ng celda-1) que en condiciones N+ (0,27 ng celda-1). El aumento observado en el contenido de carbono por célula también podría deberse probablemente a una mayor fijación de carbono a través de la fotosíntesis. Es interesante notar que no hubo diferencias significativas en el contenido total de clorofila a pesar de la privación de N. Pero el gráfico y el color de los cultivos N− sugieren una ligera reducción en el contenido de clorofila. Por lo general, el contenido de clorofila disminuye en estas condiciones debido a la pérdida preferencial de algunas proteínas del cloroplasto y, finalmente, al equilibrio del proceso fotosintético37. Además, no hubo una diferencia significativa en el rendimiento cuántico antes y después de la incubación en la oscuridad, por lo que se puede inferir que los cultivos N+ y N− son igualmente eficientes para convertir la energía luminosa en energía química durante la fotosíntesis. Sin embargo, los resultados indican que los cultivos de N- pueden soportar una mayor tasa de crecimiento y producción de paramilón, lo que sugiere que el aparato fotosintético de estos cultivos fue más eficiente y se adaptó para hacer frente a la falta de N. Anteriormente se ha planteado la hipótesis de que las microalgas en condiciones de limitación de N, con menor pigmentación, tienen una alta eficiencia fotosintética38. Esto también se observó en plantas de girasol donde el rendimiento cuántico máximo no se vio afectado por la deficiencia de N39. Además, se ha demostrado que múltiples vías de fijación de C (C3, C4 o CAM) coexisten en algunas algas marinas40,41. Entre los cuales, la vía CAM juega un papel crucial en el mantenimiento de la fotosíntesis de las plantas en condiciones de estrés y puede fijar el carbono durante la noche. Anteriormente se informó que los metabolitos relacionados con la vía CAM son estimulados por estrés químico en E. gracilis, lo que indica su existencia. Por lo tanto, es posible que la activación de la vía CAM bajo una falta de N semicontinua prolongada pueda contribuir a la actividad fotosintética activa y al aumento de la fijación de C en E. gracilis.

Se observaron resultados similares en el crecimiento y el rendimiento del producto en un estudio reciente en un mutante de Scenedesmus obliquus (SO120G) en condiciones de N-33. Mientras que el contenido de clorofila en el estudio actual no fue mayor que el control, a diferencia del caso con SO120G33. Se reveló que tales respuestas en SO120G son el resultado de la regulación al alza de genes relacionados con el complejo citocromo b6/f (Pet B) y el transportador de transporte de electrones fotosintético (Pet J). Estas proteínas median la transferencia de electrones del fotosistema II al fotosistema I y el transporte cíclico de electrones, mejorando la eficiencia fotosintética. En E. gracilis, petB se identificó como parte del complejo de operón petB-atpB-atpE en el genoma del cloroplasto como las plantas terrestres42. La activación de este gen también induce la expresión del complejo ATP-sintasa, que es esencial para la síntesis de ATP para la formación de células y productos. También es posible que la ligera reducción en el contenido de Chl haya mejorado la eficiencia de penetración de la luz en el cultivo y, a su vez, la formación del producto. Durante las horas iniciales de privación de nutrientes, la tasa de formación del producto se inducirá rápidamente seguida de una disminución gradual43. Este exceso de luz podría suministrar la energía necesaria para la formación del producto en condiciones de privación de N44.

Al contrario de un alto crecimiento en la condición N-, una tasa de crecimiento más baja en la condición N+ también es un resultado importante para comprender la productividad de la biomasa. Muchas especies de microalgas prefieren el nitrógeno en forma de amonio, y las altas concentraciones de amonio en el medio de cultivo mejoran la capacidad de las algas para absorber iones NH4+. Sin embargo, esto también da como resultado un flujo excesivo de NH4 que puede dificultar la formación de ATP y la regulación de la fotosíntesis45. Esto puede provocar intoxicación por amonio, en la que la tasa de conversión de amonio en aminoácidos será más lenta que su entrada en las células, lo que reducirá la tasa de crecimiento en condiciones N+46. Además, esto va acompañado de una disminución del pH, lo que reduce la eficiencia de la fijación de CO2 por parte de las algas. En este estudio, el pH se mantuvo consistentemente entre 2,3 y 2,5 en condiciones N+ y N−, y las células parecían exhibir un crecimiento activo, lo que indicaba la ausencia de envenenamiento por amonio.

Los hallazgos de este estudio sugieren que este método de cultivo puede mejorar el rendimiento de E. gracilis. y es una consideración importante para la viabilidad económica del cultivo de algas. El método también reduce el costo de los insumos de nutrientes. Además, el cultivo de E. gracilis utilizando esta técnica en combinación con desechos de nutrientes industriales, digestatos anaeróbicos de desechos orgánicos y CO2 de escape de las centrales eléctricas podría promover una economía circular y contribuir a un medio ambiente limpio y sostenible9,47. Además, este enfoque puede aplicarse a otras microalgas, proporcionando una fuente sostenible de biocombustibles y otros bioproductos.

Sin embargo, el cultivo en estanque abierto presenta varias limitaciones9. Mantener un sistema de cultivo estable durante todo el año es un desafío, ya que depende de condiciones climáticas favorables, como temperaturas cálidas y suficiente luz solar, y por lo tanto está restringido a regiones geográficas específicas. En este estudio, se observó una correlación entre las condiciones de crecimiento, como la intensidad de la luz, la temperatura y el consumo de nitrógeno con el tiempo, lo que indica los efectos de las variaciones estacionales. Los sistemas de estanques abiertos también son vulnerables a la contaminación por otros microorganismos como bacterias y otras algas, lo que requiere controles de contaminación frecuentes. En este estudio, no se encontró que la contaminación fuera significativa cuando el pH se mantuvo por debajo de 2,5. Además, las altas temperaturas en los estanques abiertos pueden provocar la pérdida de agua debido a la evaporación, lo que reduce la productividad. Por lo tanto, es necesario monitorear y mantener regularmente los niveles de agua en los estanques para garantizar una productividad óptima. Por lo tanto, a pesar del potencial del cultivo en estanques abiertos, es importante tener en cuenta estas limitaciones al diseñar un sistema de cultivo de algas para la producción comercial.

En conclusión, este estudio ha demostrado que E. gracilis tiene un mecanismo de adaptación distintivo en condiciones prolongadas de N- que no se observaron previamente. Los hallazgos mostraron un aumento gradual en el número de células, un tamaño de célula más pequeño en comparación con las condiciones de control y una actividad fotosintética no afectada. Se necesitan más estudios ómicos para comprender los mecanismos reguladores que contribuyen a estas observaciones únicas. Los resultados de este estudio tienen implicaciones prometedoras para la producción a escala industrial de E. gracilis y paramylon utilizando solo la cepa de tipo salvaje. Se puede adoptar el cultivo semicontinuo en estanques abiertos con bajo contenido de nutrientes, lo que reduciría los costos operativos y aumentaría la biomasa y el rendimiento del producto.

Para el experimento se utilizó E. gracilis mantenida en Euglena Co., Ltd. (Tokio, Japón). Todos los experimentos, incluido el escalado de semillas, se realizaron utilizando medio Cramer Myers (medio CM)1,28 con sulfato de amonio ((NH4)2SO4) como fuente de nitrógeno (N) a una concentración de 70 mg L−1. Inicialmente, se prepararon cultivos de semillas de 2 L a partir del cultivo madre y luego se ampliaron hasta 30 L en el laboratorio. La temperatura, la aireación y la intensidad de la luz para los cultivos de semillas se mantuvieron a 30 °C, 0,01 vv-1 min-1 (10% CO2) y 800 μmol m-2 s-1 (continuamente iluminados por lámparas fluorescentes), respectivamente. Este cultivo se amplió aún más en estanques abiertos a partir de 1 m2 y aumentando 50 m2, 500 m2 y finalmente a un estanque raceway de 1000 m2. Cada paso de escalamiento tardó aproximadamente 7 días. Antes del experimento principal, el cultivo en canal de 1000 m2 se mantuvo de forma semicontinua durante 4 meses con la adición semanal de medio CM fresco.

Este estudio se realizó entre julio de 2022 y octubre de 2022, utilizando seis tanques de 1 m2: R11, R12, R13, R14, R15 y R16. Los cultivos de algas se cultivaron de forma semicontinua en un ciclo semanal, con una fase experimental de 5 días seguida de una fase de mantenimiento de 2 días para permitir un crecimiento suficiente hasta el próximo ciclo. En tres tanques (R11, R14 y R15) los cultivos estaban en condiciones de control con niveles suficientes de nitrógeno (N+), y los otros tres en R12, R13 y R16 en condiciones de privación de nitrógeno (N–) (Fig. 1) . El proceso de cultivo de privación de N implicó someter los cultivos a condiciones de N- del día 3 al día 5 cada semana, mientras que los días restantes se mantuvieron en condiciones de N+.

Al comienzo de cada experimento semanal (día 1), la concentración de biomasa inicial en cada estanque de 1 m2 se ajustó a aproximadamente 50 gm-2, seguido de la adición del medio CM requerido sin la fuente de N. A continuación, los estanques se llenaron hasta una altura de 200 mm desde el fondo con agua del grifo (volumen total de 170 l). Para los estanques de N+, se agregó (NH4)2SO4 como fuente de N a una concentración de aproximadamente 65 mg L−1. Para los estanques de N-, la concentración inicial de N-amonio se fijó entre 4 y 8 mg L-1 y se mantuvo por encima de 2 mg L-1 durante los primeros 2 días de cada ciclo. Después de los primeros dos días, el N en el cultivo fue completamente consumido por las células y llega por debajo del nivel de detección (0 mg L−1). Luego, los estanques se dejaron en condiciones de N- durante los siguientes 3 días. El día 5 después del muestreo, se agregaron 15–30 mg L−1 (NH4)2SO4 a los estanques de N− para mantener la concentración de amonio-N por encima de 2 mg L−1 durante dos días hasta el próximo ciclo. Es crucial controlar y mantener los niveles de (NH4)2SO4 hasta el paso de privación de N para evitar que las células experimenten privación de nitrógeno antes del inicio del experimento. El pronóstico del tiempo (temperatura, nubosidad y lluvia) fue monitoreado de cerca para los días siguientes y se agregó la cantidad requerida de (NH4) 2SO4 en consecuencia para lograr la inanición de N para el día 3 en los estanques de N−. El mismo ciclo se repitió en la semana siguiente. Este ciclo se repitió semanalmente hasta finales de octubre de 2022. Además, la mezcla del cultivo se mantuvo haciendo funcionar las dos ruedas de paletas hechas a medida a 75 rpm. Se suministró aireación con 10 % de CO2 a todos los estanques a una tasa de 0,01 vv−1 min−1 y el pH se mantuvo entre 2 y 2,5.

Se realizaron muestreos diarios a las 17:00 h para medir la biomasa (peso seco de las células), el número de células, el tamaño y el contenido de NH4-N en todos los estanques. Cada segundo y último día del experimento semanal, se recogieron 1,5 L de cultivo a las 15:00 h y se liofilizaron para hacer muestras de polvo.

La fisiología celular y la contaminación se evaluaron diariamente utilizando un microscopio vertical OLYMPUS CX-41. El número de células y el volumen se midieron utilizando el contador de partículas del sistema Sysmex CDA-1000 (Sysmex corp., Hyogo, Japón).

Los filtros de fibra de vidrio (47 mm de diámetro, tamaño de poro ADVANTEC, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokio, Japón) se secaron durante 2 h (h) a 100 °C en un horno y se pesaron después de enfriar. La muestra de diez mililitros se filtró a través de un filtro y luego se enjuagó (O se lavó) tres veces con 10 ml de agua destilada (Dw). (Todos los pasos de filtración se realizaron con una suave succión al vacío). El filtro húmedo se secó durante 2 horas a 100 °C antes de pesarlo. La productividad de la biomasa se midió por la tasa de crecimiento y la tasa de crecimiento específica, que se calcularon de la siguiente manera;

donde DMi es el peso seco (OR masa) en el día ti y v representa la cantidad de muestra (10 mL). Se promediaron los valores de las mediciones por triplicado.

La concentración de paramilón se determinó según Ogawa et al. 201517. Las observaciones se midieron utilizando un lector de absorbancia basado en rejillas SH-1300Lab (Corona Electric Co., Ltd., Ibaraki, Japón).

El flujo de fotones diario se registró con un registrador de flujo de fotones (Eko-photon sensor ML-020P, EKO, Japón), y la temperatura del agua en los estanques se registró con un registrador de temperatura (Thermo Recorder TR-52i, T&D Corporation, Japón).

La extracción total de clorofila se realizó a partir de 1 ml de sedimento de cultivo de E. gracilis utilizando metanol al 100 % [Toyama et al., 2019]. Para la medición de la absorbancia se utilizó un espectrofotómetro UVmini-1240 (Shimadzu Co. Ltd., Kyoto, Japón). El contenido de clorofila total (Chl a + b, µg mL−1) se calculó de la siguiente manera48;

donde A665 y A650 representan la absorbancia a la longitud de onda de 665 nm y 650 nm, respectivamente.

Además, para comprender la influencia de la inanición semicontinua de nutrientes en la actividad fotosintética, medimos el rendimiento cuántico (Qy o Fv/Fm). La eficiencia fotosintética (Qy) se midió usando AquaPen E-AP 110-C (Environmental Measurement Japan, CO., LTD., Japón). De cada estanque se recogieron dos muestras frescas de 10 ml cada una. Una muestra se envolvió con papel de aluminio y se mantuvo en la oscuridad durante 1 h antes de la medición de Qy, mientras que la otra se midió inmediatamente después del muestreo. Tanto el contenido de Chl como la eficiencia fotosintética se midieron durante las últimas dos semanas de todo el experimento.

Los contenidos de carbono total (TC) y nitrógeno total (TN) fueron analizados por Sumica Chemical Analysis Services Ltd., Japón. Se usaron para la medición muestras secas de E. gracilis recolectadas el día 5 (último día de condición N-) de tres experimentos semanales consecutivos (semana 1 a 3). El promedio de estos datos se consideró como el contenido máximo de C y N disponible en las celdas al final de cada ciclo. Se midió el NH4-N en el medio utilizando el medio libre de células de 1 ml de suspensión celular. La muestra se centrifugó primero a 10.000 rpm durante 1,5 min utilizando una mini centrífuga de alta velocidad (GUSTO® HIGH-SPEED MINI CENTRIFUGE, HEA10050, ILLINOIS, EE. UU.), y el sobrenadante obtenido se utilizó para medir el contenido de NH4-N utilizando Digital Pack Prueba Multi SP: DPM-MTSP (Kyoritsu Chemical-Check Lab. Corporation, Japón).

Se realizó un análisis estadístico para evaluar la diferencia entre las condiciones N− y N+ utilizando el software R-studio versión 4.2.1. Los datos de tasa de crecimiento (G) y diámetro (D) se dividieron en 3 grupos diferentes denominados marcos de datos (DF): DF1, DF2 y DF3. DF1 representa todos los datos de la semana desde solo el día 1, DF2 representa los datos de los días 3 a 5 y DF3 representa todos los datos de 5 días. Se realizó ANOVA unidireccional en cada uno de los G-DF y D-DF, así como en el contenido de clorofila y Qy. El nivel significativo para todas las pruebas se fijó en 0,05. Para la tasa de crecimiento, el día 1 se calculó como la diferencia entre el día 2 y el día 1 según la ecuación en (1), y de manera similar para los días 3–5. Para el diámetro de celda, los días representan la línea de tiempo real. Además, también se realizó un análisis de correlación de Pearson para examinar las correlaciones entre la radiación solar, la temperatura y el tiempo (en días y semanas) con variables como el contenido de N en las células, el diámetro de las células N+ y el diámetro de las células N−.

Todos los datos se proporcionan en el manuscrito como figuras, tablas y datos complementarios.

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Este estudio se basa en los resultados obtenidos de un proyecto encargado por la Organización para el Desarrollo de Nuevas Energías y Tecnologías Industriales (NEDO), Gob. de Japón, Japón. Agradecemos a Mieko Oue, Akiko Nishimura y Yui Yamamoto por su soporte técnico. También agradecemos a Koji Yamada.

Instituto de Investigación de Tecnología de Energía de Algas, 649-17 Nishiyama, Taki-cho, Taki-gun, Mie, 519-2171, Japón

Ranjith Kumar Bakku, Yoshimasa Yamamoto, Yu Inaba, Taro Hiranuma, Enrico Gianino, Lawi Amarianto, Waleed Mahrous y Hideyuki Suzuki

Euglena Co., Ltd., G-BASE Tamachi 2nd and 3rd Floor, 5-29-11, Shiba, Minato-ku, Tokio, 108-0014, Japón

Ranjith Kumar Bakku, Yoshimasa Yamamoto, Yu Inaba, Taro Hiranuma, Enrico Gianino, Lawi Amarianto, Waleed Mahrous, Hideyuki Suzuki y Kengo Suzuki

Laboratorio de tecnología de control de producción de microalgas, RIKEN 1-7-22, Suehiro, Tsurumi, Yokohama, Kanagawa, 230-0045, Japón

kengo suzuki

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RKB realizó los experimentos, el análisis de datos y la redacción del manuscrito. Y. Y realizó un análisis de paramilón. IY, TH, EG, LA & WM apoyaron en la preparación de estanques, instalación eléctrica, muestreo y mantenimiento de estanques. HS, & KS concibieron y diseñaron experimentos. Todos los autores contribuyeron por igual a la redacción y revisión del manuscrito.

Correspondencia a Ranjith Kumar Bakku o Hideyuki Suzuki.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Bakku, RK, Yamamoto, Y., Inaba, Y. et al. Nuevos conocimientos sobre el cultivo en raceway de Euglena gracilis bajo hambre de nitrógeno semicontinua a largo plazo. Informe científico 13, 7123 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34164-1

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Recibido: 23 de diciembre de 2022

Aceptado: 25 de abril de 2023

Publicado: 02 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34164-1

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