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Dec 07, 2023

Estimación de una biopelícula

npj Biopelículas y Microbiomas

npj Biofilms and Microbiomes volumen 1, Número de artículo: 15014 (2015) Citar este artículo

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Detalles de métricas

Las biopelículas y específicamente las biopelículas que hidrolizan la urea son de interés para la comunidad médica (por ejemplo, infecciones del tracto urinario), científicos e ingenieros (por ejemplo, precipitación de carbonato inducida por microbios). Para modelar adecuadamente estos sistemas, se requieren velocidades de reacción específicas de biopelículas. Se describe un método simple para determinar las velocidades de reacción específicas de la biopelícula y se aplica a una biopelícula que hidroliza la urea.

Las biopelículas se cultivaron en pequeños tubos de silicona y se determinaron las concentraciones de urea afluentes y efluentes. Inmediatamente después del muestreo, los tubos se seccionaron en forma delgada para estimar el perfil de espesor del biofilm a lo largo del tubo. Los datos de concentración de urea y espesor de biopelícula se utilizaron para construir un modelo inverso para la estimación de la tasa de hidrólisis de urea.

Se encontró que la hidrólisis de urea en biopelículas de Escherichia coli MJK2 se aproxima bien a la cinética de primer orden entre concentraciones de urea de 0,003 y 0,221 mol/l (0,186 y 13,3 g/l). El coeficiente de velocidad de primer orden (k1) se estimó en 23,2±6,2 h−1. También se determinó que la advección dominaba el sistema experimental en lugar de la difusión, y que la hidrólisis de urea dentro de las biopelículas no estaba limitada por el transporte difusivo. Más allá de la biopelícula de hidrolización de urea específica discutida en este trabajo, el método tiene el potencial para una amplia aplicación en los casos en que se deben determinar las tasas específicas de biopelícula.

La hidrólisis de urea por microorganismos se ha mostrado ampliamente como un método eficaz para la producción in situ de alcalinidad y la posterior precipitación de minerales carbonatados. A pH circumneutral, la hidrólisis de urea (CO(NH2)2) se puede escribir como

donde se forman dos iones de amonio y un ión de bicarbonato por cada molécula de urea que se hidroliza. Además, se consume un protón que eleva el pH. Cuando el calcio u otros cationes divalentes están presentes, la precipitación de minerales de carbonato puede ser posible debido a un aumento en la concentración de carbonato (CO32-).

La formación de minerales de carbonato a través de la ureólisis microbiana es importante en medicina debido al papel que los microorganismos ureolíticos pueden tener en la formación de cálculos renales y del tracto urinario, así como en las incrustaciones de catéteres.1,2 La formación de minerales a través de la ureólisis también se ha estudiado ampliamente para aplicaciones de ingeniería en materiales de construcción3 y en el subsuelo para la reducción de la permeabilidad, la estabilización del suelo y la remediación de contaminantes.4 La hidrólisis microbiana de la urea también es de interés en entornos de tratamiento de aguas residuales industriales y agrícolas donde una porción significativa del nitrógeno total se atribuye a la urea.5 En todos los sistemas mencionados arriba, particularmente donde la relación área superficial/volumen es alta, es probable que una parte significativa de la actividad ureolítica se atribuya a las biopelículas.

Un obstáculo importante para predecir el comportamiento del sistema en sistemas que contienen biopelículas es la falta de caracterización cuantitativa del transporte reactivo específico del sistema. Este estudio analiza específicamente la ureólisis en un sistema de biopelícula modelo para arrojar luz sobre el entorno de transporte reactivo que probablemente esté presente en los sistemas que tienen, o han sido estimulados para tener, actividad ureolítica. La ureólisis en cultivos planctónicos se ha investigado a fondo y ha habido una serie de estudios para cuantificar las tasas de ureólisis promediadas por volumen en medios porosos que contienen microorganismos6–9 y enzima inmovilizada.10,11 Los estudios más aplicables se concentran en la tasa de precipitación en estos sistemas. dejando las características de transporte reactivo a microescala de la ureólisis en biopelículas en gran parte sin discutir.

En lugar de adoptar un enfoque de volumen promedio, las biopelículas ureolíticas se cultivaron en tubos de silicona que imitan el entorno de flujo laminar que se encontraría en un poro del suelo o en el tracto urinario. No se suministró al sistema calcio ni otros cationes que causaran la precipitación mineral, por lo que se pudo estudiar en detalle la hidrólisis de la urea sin las complicaciones introducidas cuando se produce la precipitación. La precipitación tiene el potencial de afectar la cinética de la hidrólisis de la urea, pero no se investigó en este estudio. Los tubos de silicio se tomaron muestras de forma destructiva y se seccionaron finamente para obtener un perfil de espesor de biopelícula preciso a lo largo del tubo. Los perfiles de espesor de biopelícula se combinaron con mediciones de urea afluente y efluente para obtener una tasa de ureólisis por volumen de biopelícula (aquí denominada tasa específica de biopelícula). Este documento proporciona un método para la medición de las tasas de reacción efectivas en biopelículas y una mayor comprensión del entorno de transporte reactivo de la hidrólisis de urea catalizada por biopelículas mediante la aplicación de técnicas de no dimensionalización.

Se cultivaron biopelículas de Escherichia coli MJK2 (ref. 12) en tubos de silicona de 10 cm de largo y tamaño 14 (Masterflex, Cole-Parmer, IL, EE. UU.) con concentraciones de urea entrante que oscilaban entre 0,011 y 0,221 mol/l ) a temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C). E. coli MJK2 posee un plásmido pJN105 que ha sido modificado para contener el operón de ureasa de E. coli DH5α (pURE14.8) y también lleva un gfp cromosómico mutante (gen de la proteína fluorescente verde).13,14 Los experimentos se iniciaron mediante la inyección de inóculo en un conjunto de reactor esterilizado en autoclave y permitiendo que las células se adhieran durante 1 h. Consulte el Material complementario en línea para obtener detalles sobre la cepa y la preparación del inóculo. Luego se inició el flujo a 1,0 ml/h (número de Reynolds (Re) de 0,1 en un tubo limpio) y se mantuvo a 1,0 ml/min durante 10 días con una bomba de jeringa multicanal KDS220 (KD Scientific, Holliston, MA, EE. UU.). El flujo solo se detuvo durante períodos breves para cambiar jeringas de plástico estériles de 60 ml llenas de medio estéril. El tubo de silicona se conectó a la jeringa a través de un tubo PEEK de diámetro interior pequeño (0,127 mm) (consulte la Figura 1). El tubo de diámetro interior pequeño está diseñado para minimizar el tiempo de residencia y generar un entorno de alto cizallamiento que no conduce al crecimiento de biopelículas en el tubo de entrada. Sin crecimiento de biopelícula, el tiempo de residencia hidráulica promedio es de 4,5 s en la tubería de entrada y 12,1 min en el reactor de tubo de silicio.

Un esquema para el ensamblaje del reactor de tubo. El medio LB estéril se bombea a través de un tubo de silicona de 10 cm de largo y 1,6 mm de diámetro interior (DI) con una biopelícula que crece en las paredes. Se usó un tubo afluente de DI pequeño para conectar la jeringa al reactor de tubo. Se usó una válvula de tres vías para tomar muestras del afluente y se desconectó el extremo aguas abajo del reactor tubular para tomar muestras del efluente.

Después de 10 días de crecimiento del biofilm, se tomaron tres muestras de efluentes consecutivas y una muestra de afluentes. Se tomaron las tres muestras de efluentes consecutivas para demostrar el comportamiento en estado estacionario. Los tubos que tenían al menos una concentración de urea efluente consecutiva que se desviaba de la media de las tres muestras en un 25 % no se usaron en análisis posteriores. La alta variación entre réplicas en serie indica un comportamiento transitorio, como eventos de desprendimiento de biopelículas durante el muestreo, lo que hace que el conjunto de datos no sea adecuado para el modelado. La última muestra de efluente tomada de cada tubo se consideró representativa y se usó en todos los modelos posteriores porque se tomó más cerca del final del experimento cuando se prepararon las muestras de sección delgada.

Se tomaron muestras de efluentes desconectando el extremo aguas abajo del tubo y dejando que el medio fluya en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a la velocidad de flujo experimental durante 1 hora. La muestra del afluente se tomó en último lugar dirigiendo el flujo al tubo de muestra mediante la válvula de tres vías, como se muestra en la Figura 1. Se pesaron los tubos de microcentrífuga vacíos, se agregaron 100 μl de HCl al 3,8 %, se pesaron, se agregó la muestra y se pesaron nuevamente. El pH final de la muestra de aproximadamente 1,5 es efectivo para detener la ureólisis porque se ha demostrado que la enzima ureasa pierde actividad a un pH bajo. Randor, PA, EE. UU.) y se refrigeraron para la posterior medición de las concentraciones de urea mediante HPLC. Inmediatamente después de que se tomó la muestra de líquido, se tomaron muestras destructivas de los tubos de silicio para la determinación de los perfiles de espesor de la biopelícula mediante cortes finos, como se describe en la sección "Medidas de espesor de la biopelícula".

Inmediatamente después de la toma de muestras de líquido, se diseccionaron los tubos para determinar un perfil de espesor de biopelícula a lo largo de cada tubo. Cada tubo de 10 cm se cortó en cinco secciones de 2 cm de largo. Se cortó 1 cm del centro de cada sección y se cortó por la mitad a lo largo con un bisturí quirúrgico. El líquido restante se eliminó cuidadosamente con papel de seda antes de dispensar Tissue-Tek OCT Compound (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA, EE. UU.) en la sección transversal de cada tubo y colocarlo en hielo seco para congelarlo. Una vez que la OCT estuvo completamente congelada, la sección transversal del tubo se despegó dejando la biopelícula incrustada en la OCT. La investigación microscópica mostró que no quedó ninguna biopelícula significativa en el tubo. A continuación, la biopelícula congelada e incrustada se incrustó por completo en OCT en un molde de criofijación de tejidos. Las muestras congeladas se almacenaron a -20 °C para su posterior corte fino.

Las muestras de biopelículas congeladas se cortaron en secciones transversales de 5 μm de espesor y se montaron en un criostato Leica CM1850. Las secciones se montaron en portaobjetos de microscopía cargados (Fisherbrand Superfrost Plus Stain, Fisher Scientific, Hampton, NH, EE. UU.) y se secaron al aire. Se tomaron cinco secciones para cada segmento de tubo. La proteína verde fluorescente producida por la bacteria se obtuvo mediante microscopía de epifluorescencia. Se tomaron imágenes de secciones delgadas en un microscopio Nikon E-800 equipado con una cámara CCD CoolSNAP MYO (Photometrics, Tucson, AZ, EE. UU.), fuente de luz PhotoFluor LM-75 (89 North Inc., Burlington, VT, EE. UU.), Nikon Plan Apo 10X/0.45 DIC L ∞/0.17 WD 4.0 objetivo y cubo de filtro FITC (EX 480/30, DM 505 LP, EM 535/40). Las imágenes sin procesar de 16 bits tenían 1940 × 1460 píxeles con un tamaño de píxel de 0,4499 μm. Todas las imágenes de fluorescencia se obtuvieron con un tiempo de exposición de 2 s.

Las imágenes sin procesar se umbralizaron en el software de código abierto FIJI16 utilizando el método del triángulo automático.17 El método del triángulo demostró proporcionar los resultados más representativos sobre otros métodos de uso común, como Otsu (1979). Las imágenes con umbral se cuantificaron para determinar los espesores promedio de biopelícula (Lf). Esto se hizo dividiendo la longitud de arco calculada de la sección del tubo que se muestra en la imagen (0,923 mm, consulte la Tabla complementaria SI) por el área de la sección transversal del biofilm que se obtuvo de la imagen con umbral.18 Imágenes que contenían defectos significativos fueron excluidos del análisis. Los defectos incluían partículas de polvo, burbujas e irregularidades geométricas que causarían imprecisión en las mediciones de espesor. Se presenta el espesor promedio de todas las réplicas utilizables (consulte las Tablas complementarias SIII–SX para los cálculos de espesor y los datos sin procesar). No se tomaron imágenes cuando las muestras no contenían ningún biofilm visible y el espesor se registró como cero. La figura 2 muestra una sección delgada típica y el análisis que se realizó sobre ella.

Un ejemplo representativo de una imagen de sección delgada. (a) Una imagen de luz transmitida muestra una representación cualitativa de la biopelícula. (b) La imagen de fluorescencia, que muestra la señal de la proteína fluorescente verde (GFP), se utiliza para la cuantificación. (c) La imagen de fluorescencia GFP tiene un umbral para diferenciar entre biopelícula (blanco) y fondo (negro), formando una imagen binaria. El área de la señal de biopelícula se cuantifica y se divide por la longitud de arco visible calculada (0,923 mm) para calcular un espesor de biopelícula promedio representativo.

La urea se analizó mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) con derivatización en el muestreador automático.12,19

Los reactores tubulares se modelaron utilizando COMSOL Multiphysics versión 4.3a (COMSOL Inc., Burlington, MA, EE. UU.) para ajustar los parámetros cinéticos al consumo de urea medido a lo largo de los reactores tubulares. Los reactores tubulares se modelaron como una geometría axisimétrica rotada bidimensional. Las ecuaciones de Navier-Stokes se resolvieron para obtener un campo de flujo y se supuso que no hay flujo de fluido en el dominio de la biopelícula. Los datos de sección delgada se usaron para reconstruir el perfil de biopelícula para cada reactor de tubo. Se asumió que el grosor de la biopelícula era constante para valores discretos de x (consulte la Figura 3 para conocer las coordenadas del modelo) y el grosor se interpoló linealmente entre los puntos medidos. El espesor del biofilm no se pudo medir inmediatamente en el afluente o efluente de los reactores (x=0 y 10 cm) debido a posibles artefactos debido a la remoción de los tubos de silicio del sistema experimental, por lo que se asumió que Lf en x=0 cm equivalía a Lf en x=1 cm y Lf en x=10 cm equivalía a Lf en x=9 cm. El transporte de urea se calculó con advección por el campo de flujo de Navier-Stokes y difusión de Fickian. No se consideró ninguna reducción en el transporte difusivo en el dominio del biofilm, por lo que se supuso que las características de difusión eran constantes durante toda la simulación. El análisis preliminar mostró que implementar una mayor resistencia al transporte de masa de solutos en la biopelícula como en la ref. 20 afectó mínimamente la tasa de ajuste (<1 % de diferencia en las biopelículas más gruesas, datos no mostrados). Las condiciones de contorno y los supuestos de modelado se indican en la Figura 3.

Descripción general del modelo COMSOL con condiciones de contorno.

Se supuso que la velocidad de reacción de hidrólisis de la urea, R, era constante dentro de toda la biopelícula en cada tubo (independientemente de la concentración) y restringida al dominio de la biopelícula (sin reacción en la fase líquida). La justificación de la suposición de velocidad de reacción constante se encuentra en la sección 'Caracterización del transporte reactivo'. Las concentraciones de urea afluente y efluente se conocen, por lo que la tasa de hidrólisis de urea se ajustó de manera que las concentraciones determinadas experimentalmente se ajusten al modelo. La concentración de urea en el límite de salida no es constante en el espacio (es decir, a lo largo de la sección transversal de la salida); por lo tanto, en lugar de minimizar directamente la diferencia entre las concentraciones modeladas y experimentales, se minimizó la diferencia entre el flujo de urea modelado y experimental promediado a través de la sección transversal del tubo. La última de las tres concentraciones de urea del efluente se tomó como la concentración promedio representativa a lo largo de la sección transversal del tubo porque se tomó más cerca del momento del muestreo destructivo. El flujo de urea del efluente conocido, JEF, se puede calcular multiplicando la concentración del efluente, CEF, por la tasa de flujo volumétrico, Q tal que

CEF es un valor promedio y bien mezclado. El flujo de urea del efluente total modelado, J'EF, se calculó integrando sobre el área de la fase líquida en el efluente tal que

donde u es la componente x de la velocidad del fluido, C es la concentración local de urea e ID es el diámetro interior del tubo (1,6 mm). El modelo se ejecutó de forma iterativa en la que se varió la tasa de ureólisis del biofilm de tal manera que se minimiza la suma del error cuadrático entre JEF y J′EF. Se usó el módulo de optimización COMSOL para encontrar una tasa de hidrólisis de urea, R, que minimiza el error cuadrático, (JEF−J'EF)2, usando el método Nelder-Mead21,22 con una tolerancia de ajuste adimensional de 10−6.

Los valores de velocidad ajustados para cada tubo se compilaron en un conjunto de datos que representa las velocidades de reacción en un rango de concentraciones de urea. Se calculó una concentración de urea promedio dentro del volumen de biopelícula, CUrea,BF, para cada tubo y se tomó como la concentración de urea representativa correspondiente a la tasa que se ajustó. Se ajustó una tasa de Michaelis-Menten (M-M), Rm-m, a los datos compilados utilizando la herramienta de ajuste de curvas de mínimos cuadrados (cftool) en MATLAB R2012a (The MathWorks, Inc., Natick, MA, EE. UU.):

Rmax es la tasa de ureólisis máxima y km es un coeficiente de saturación medio. Se teorizó que la relación M-M se ajustaría mejor a los datos, pero otras relaciones de tasas eran adecuadas para la comparación. Para una reacción de orden, n, con respecto a la concentración de urea, una ley de velocidad generalizada se puede escribir como

Las relaciones de primer orden (n=1, lineal) y de orden cero (n=0, tasa constante) se han utilizado anteriormente para describir la ureólisis microbiana7,12,23,24, por lo que también se incluyeron en el análisis de regresión.

Se observó hidrólisis de urea medible en todos los reactores tubulares después de 10 días de funcionamiento. Las concentraciones de urea afluente variaron entre 0,011 y 0,221 mol/l. Las concentraciones de efluentes variaron entre 0,003 y 0,208 mol/l, incluidas todas las réplicas en serie. Los tubos 5, 10 y 11 se eliminaron del análisis porque no se cumplió la condición de estado estacionario (>25% de desviación de la media). Se remite al lector a la Tabla Suplementaria SII para todas las mediciones de urea.

Los perfiles de biopelícula se obtuvieron con éxito a partir de 11 corridas de reactores tubulares. Los espesores de biopelícula oscilaron entre 0,6 y 222,0 μm con un promedio de todas las observaciones de 18,7 μm. Suponiendo un flujo cero a través de la biopelícula, se espera un flujo laminar en todos los reactores tubulares (se calculó un Re = 0,18 máximo para el reactor con la biopelícula más gruesa observada).

Se recogieron cinco mediciones duplicadas del grosor del biofilm para cada punto del perfil. El 5,5% de las medidas fueron eliminadas del análisis debido a aparentes irregularidades como burbujas en el medio de corte, partículas de polvo y secciones deformadas. Todas las medidas de grosor del biofilm presentadas se midieron al menos por duplicado con un promedio de 4,7 medidas por valor de grosor. Las mediciones de biopelículas sin procesar se pueden encontrar en el Material complementario en línea y los perfiles promedio utilizados en el modelo se pueden encontrar en la Figura 4.

Concentración de urea predicha por el modelo de transporte reactivo para cada reactor tubular utilizado en el análisis. El mapa de concentración para todos los tubos se traza utilizando la misma escala de colores, lo que hace evidente que cada tubo tenía un rango de concentración de urea diferente pero dentro de cada tubo muy estrecho. Los perfiles de biopelícula para cada tubo obtenidos a partir de datos de microscopía se muestran como líneas blancas en cada panel. Tenga en cuenta los gradientes de concentración muy leves radialmente hacia afuera desde el centro de los tubos.

Hay algunas fuentes distintas de error asociadas con el experimento del reactor tubular que deben abordarse. Se espera que la fuente de error más importante esté en la definición del perfil de espesor del biofilm. Si el grosor de la biopelícula en todo el tubo no está bien caracterizado, las tasas calculadas no son precisas porque el ajuste de la tasa depende implícitamente de la cantidad de biopelícula presente. Hay cinco posibles fuentes de error para la estimación del perfil de espesor de la biopelícula: (i) la biopelícula en el afluente y el efluente de los tubos no se puede cuantificar con precisión, (ii) el espesor de la biopelícula entre los puntos de medición puede no aproximarse bien por interpolación lineal, (iii) el grosor de la biopelícula puede no ser constante en toda la sección transversal del tubo y (iv) es posible que ocurran eventos de desprendimiento significativos durante el muestreo para el análisis acuoso.

En las primeras tres posibles fuentes de error, el problema es que todo el tubo y la biopelícula dentro de ese tubo no pueden ser razonablemente reflejados en tres dimensiones. Estos errores están directamente relacionados con la falta de capacidad para muestrear a una alta resolución espacial y pueden considerarse errores aleatorios. Se puede esperar que los errores aleatorios en este sistema tengan la misma probabilidad de sobreestimación que de subestimación. En otras palabras, es probable que el régimen de muestreo pase por alto un área gruesa de biopelícula como un área delgada. Aunque se requerirían técnicas más avanzadas, el problema de la baja resolución espacial se puede resolver. Las técnicas de imágenes tridimensionales, como la microtomografía de rayos X25–27 y las imágenes de resonancia magnética nuclear28,29, tienen el potencial de generar imágenes de sistemas de biopelículas simples y vincular mejor la geometría de las biopelículas con estimaciones efectivas de la velocidad de reacción.

El error asociado con los eventos de desprendimiento durante el proceso de muestreo no se puede cuantificar aquí, pero se conoce el signo del error y sus efectos. Si se produjera un gran desprendimiento durante el muestreo acuoso o entre el muestreo y el corte fino, se desconocería el perfil del biofilm durante el muestreo acuoso, pero tendría que ser más grueso de lo que se mostraría en los cortes finos. Esto siempre conduciría a una sobreestimación de la tasa de reacción efectiva en ese tubo en particular debido a la subestimación del volumen de biopelícula. De manera similar a la otra clase de errores aleatorios, este problema podría minimizarse mediante el uso de técnicas de imágenes tridimensionales más avanzadas. Estas técnicas más avanzadas aún tendrían que utilizarse con cuidado para no perturbar la biopelícula.

Existe otra posible fuente de error que no está relacionada con la estimación del espesor del biofilm. Esto se relaciona con la suposición de que la biopelícula es homogénea. Podría haber diferencias en la densidad celular, la producción de enzimas (ureasa en este caso) o la actividad metabólica general que podrían causar imprecisiones al estimar las constantes de velocidad. Esta posibilidad no se investigó directamente en este estudio, pero no se puede descartar su influencia y debería ser el foco de un trabajo futuro. Los sistemas con limitación de donante o aceptor de electrones serían particularmente interesantes para tales estudios futuros.

El número de Damköhler (Da) se define como la escala de tiempo del transporte convectivo dividida por la escala de tiempo de la reacción dentro de un volumen de control.30 Para una reacción de primer orden, el número de Damköhler se puede definir como

donde τ es el tiempo medio de retención de líquidos. Esta expresión estándar para Da requiere modificación para un sistema con tasas definidas como que ocurren solo en la fase de biopelícula. La ecuación (6) asume que la reacción ocurre dentro del volumen total para el cual se calcula τ (el volumen de líquido). En este caso, la reacción no ocurre en el volumen líquido, por lo que la velocidad de transporte y las velocidades de reacción deben normalizarse para los volúmenes en los que ocurren.

De manera similar, el número de Péclet (Pe) se puede definir como la relación entre la velocidad de advección de un soluto y la velocidad de difusión del mismo soluto.31 El número de Péclet se puede expresar como

donde D es el coeficiente de difusión, que es 1,38×10−9 m2/s para la urea en agua pura a 25 °C (ref. 31), v es la velocidad media del fluido y L es una escala de longitud representativa. Los valores de vy L se pueden elegir en función de lo que se caracteriza en el sistema. En este caso, tanto el comportamiento axial como el radial son de interés, por lo que se definen dos números de Péclet. El primero, Pex, caracteriza el comportamiento axial donde la velocidad se toma como la magnitud promedio de la componente x de la velocidad, vx. El segundo, Per, caracteriza el comportamiento radial donde la velocidad se toma como la magnitud promedio de la componente r de la velocidad, vr. Las escalas de longitud son diferentes para el comportamiento radial y axial. La longitud del tubo, ltubo, es la escala de longitud para flujo axial y el diámetro del tubo dtubo es la escala de longitud para flujo radial tal que

y

El último parámetro adimensional considerado es el módulo de Thiele (ϕ), que es la relación entre la escala de tiempo de reacción y la escala de tiempo de difusión. El módulo de Thiele es fácil de calcular para reacciones de primer orden.31

La escala de longitud (L) aquí es un espesor de biopelícula (Lf) porque el módulo de Thiele, en este caso, se calcula como una métrica para cuantificar la posible limitación de difusión de las biopelículas en este sistema. El grosor de la biopelícula no es constante en estos sistemas, por lo que se utilizan valores altos y bajos promedio para cada tubo para limitar el comportamiento general. La Tabla 1 muestra los parámetros adimensionales calculados (promedio, mínimo y máximo) para cada reactor de tubo en el estudio. Los valores utilizados en el cálculo de los parámetros adimensionales se tomaron del modelo de elementos finitos descrito en la sección 'Ajuste de parámetros cinéticos'

En general, el análisis de parámetros adimensionales muestra que la advección domina el sistema (en lugar del transporte por difusión y la hidrólisis de la urea) y que las biopelículas no están limitadas por la difusión. El número de Damköhler muestra que, para este sistema en particular, la escala de tiempo del transporte advectivo es mayor que la escala de tiempo de la reacción. Los números de Péclet axiales son todos mucho mayores que uno (Pex ≫ 1), lo que indica que el sistema está fuertemente dominado por la advección. Solo una pequeña fracción del transporte axial de urea puede contribuir a la difusión. El número de Péclet radial indica que el transporte de urea advectivo y difusivo está más equilibrado, y el transporte advectivo y difusivo contribuye de manera más equitativa en la dirección radial.

Hay dos características principales que controlan Per asumiendo un coeficiente de difusión constante. En primer lugar, el caudal a granel afecta a Per; una mayor tasa de flujo general del sistema se traducirá en mayores velocidades generales, incluidas las velocidades radiales. Segundo, la heterogeneidad del perfil del biofilm afecta directamente las velocidades radiales; a medida que el perfil del biofilm se vuelve más constante (es decir, el más cercano a Lf es igual en todos los valores de x), la velocidad radial promedio disminuirá, lo que disminuirá Per. También se puede esperar que la heterogeneidad de la tasa de flujo y el espesor de la biopelícula esté relacionada. Aunque esta relación fisiológica no se estudió aquí, se ha demostrado que las biopelículas se adaptan a sus entornos de transporte de solutos y cizalla.32,33 Se ha demostrado que las biopelículas de E. coli adaptan su arquitectura a condiciones hidrodinámicas y de nutrientes específicas. Específicamente, cuando se proporcionan nutrientes en exceso (como se espera en este estudio debido a los valores altos de Da y bajos de ϕ), se ha demostrado que las biopelículas de E. coli se adaptan para resistir la tensión de cizallamiento.34

El módulo de Thiele fue el parámetro adimensional más variable del sistema, pero se encontró que todos los valores eran menores que uno, lo que indica que la escala de tiempo para la difusión es generalmente más corta que la escala de tiempo de la reacción. Esto significa que la hidrólisis de urea dentro de las biopelículas en este estudio no está fuertemente limitada por difusión. En otras palabras, se espera que las concentraciones líquidas a granel sean aproximadamente iguales a las concentraciones que se encuentran dentro de la biopelícula (es decir, sin gradientes pronunciados en la concentración de urea). Este hallazgo es una validación importante para el enfoque que se tomó para determinar las constantes de velocidad cinética donde se asumió que la velocidad de reacción y la concentración de urea de biopelícula correspondiente (CUrea, BF) en cada tubo eran constantes. La evidencia visual del comportamiento del módulo de Thiele pequeño también se puede encontrar en la Figura 4, donde la concentración de urea no parece cambiar significativamente dentro de las biopelículas en relación con el fluido a granel.

Los reactores tubulares que cumplían con los criterios de estado estacionario se modelaron usando modelos de elementos finitos individuales, y la tasa de hidrólisis de urea, R, se varió hasta que se minimizaron las diferencias entre los flujos de urea modelados y experimentales. Se asumió que la concentración representativa correspondiente a la velocidad de reacción calculada era la concentración promedio de urea dentro del volumen de biopelícula de cada tubo.

Los datos resultantes de los modelos de elementos finitos permitieron el análisis de regresión considerando los modelos de tasa de Michaelis-Menten (M-M), de primer orden y de orden cero. En la Figura 5 se puede encontrar una gráfica de la velocidad de reacción de hidrólisis de urea frente a la concentración representativa junto con los ajustes del modelo de velocidad. Los modelos M-M y de primer orden se ajustan mejor a los datos (error cuadrático medio de 1,01 y 0,97 mol/(l h) respectivamente), mientras que el orden cero no se ajustó bien en comparación con los demás (error cuadrático medio = 1,56 mol/(l h)). Los ajustes del modelo M-M y de primer orden no son estadísticamente diferentes al 95 % de confianza en el rango de concentraciones considerado en este estudio. Se estimó que las constantes de velocidad para el modelo M–M eran km=0,55 mol/l y rmax=15,9 mol/(l h) y para el modelo de primer orden k1=23,2±6,2 h−1 (± es el intervalo de confianza del 95 % ).

Concentración promedio de urea dentro del volumen de biopelícula frente a la tasa de hidrólisis de urea estimada. Los puntos modelados corresponden a la tasa calculada por los modelos de elementos finitos frente a la concentración promedio de urea en el volumen de biopelícula, CUrea,BF. Las barras de error representan el rango de concentración de urea dentro del volumen del biofilm estimado por los modelos de elementos finitos. Los puntos están etiquetados con los números de los reactores tubulares de los que se obtuvieron (ver, por ejemplo, la Figura 4).

La demostración del comportamiento de primer orden es importante para modelar sistemas más complejos y es un hallazgo significativo en este trabajo. Otros han usado cinética de primer orden para sistemas de ureólisis que involucran mineralización impulsada por ureólisis;7,23 sin embargo, la aplicabilidad de ese modelo no se había demostrado para ningún sistema de biopelícula hasta ahora. Para las reacciones que obedecen a la cinética M-M, como se ha demostrado para la hidrólisis de la urea,11,15,35 normalmente se asume que la cinética de primer orden solo debe aplicarse a sistemas donde el sustrato de reacción está en baja concentración (C ≪ km). Los resultados que se muestran aquí indican que los valores cinéticos publicados de enzimas puras o experimentos biológicos planctónicos pueden no ser apropiados para su uso en sistemas donde las células y biopelículas adheridas son el catalizador principal. La limitación de la difusión se cita habitualmente como la razón del comportamiento cinético diferente en las biopelículas, pero los resultados de este trabajo sugieren que las diferencias cinéticas pueden ocurrir incluso sin evidencia de limitaciones significativas en el transporte de masa por difusión.

La limitación del transporte de masa de la urea se consideró en este análisis independientemente de otros solutos. Como ejemplo, también podría investigarse la limitación de oxígeno, ya que las biopelículas en la naturaleza a menudo tienen, al menos, una limitación parcial de oxígeno. En este estudio, no se espera que el oxígeno sea una limitación debido a la alta permeabilidad a los gases de los tubos de silicona utilizados, pero en los sistemas naturales el oxígeno puede agotarse, lo que podría afectar la cinética de la hidrólisis de la urea. Como resultado, es posible que sea necesario considerar las limitaciones del transporte de masa de otros solutos en otros sistemas al aplicar el enfoque descrito en este estudio.

El estudio presentado tiene aplicaciones directas e indirectas. La aplicación más directa de este trabajo es la continuación de los estudios de laboratorio utilizando E. coli MJK2. Los parámetros cinéticos específicos del biofilm obtenidos en este estudio se pueden utilizar junto con herramientas como la microscopía confocal, las celdas de flujo y el modelado de elementos finitos en sistemas más complejos para investigar más a fondo los gradientes químicos locales dentro de los biofilms ureolíticos. Los sistemas que serían particularmente adecuados incluyen catéteres ureterales1 y precipitación de carbonato microbiano impulsada por hidrólisis de urea.3,4

Más allá de los sistemas de hidrólisis de urea específicamente, este documento presenta un método sólido para la caracterización sistemática de las tasas de reacción efectivas en biopelículas en sistemas de flujo. El método del reactor tubular a pequeña escala tiene ventajas sobre los reactores de biopelícula a escala de banco de laboratorio más comunes, como el reactor CDC,36 los reactores anulares37 o los reactores de flujo por goteo.38 Las principales ventajas se relacionan con el costo y la reducción de desechos. El reactor de tubo simple no requiere equipo especializado más que una bomba de jeringa o una bomba similar que proporcione un flujo constante y lento. El entorno de corte también se puede adaptar fácilmente a los requisitos específicos del estudio variando el caudal o el tamaño del tubo. El método del reactor tubular también es adecuado para estudios en los que se utilizan materiales peligrosos. Los estudios centrados en cuantificar la degradación de sustancias peligrosas por biopelículas pueden ser útiles en estudios de reactores de tubos pequeños porque se podrían diseñar experimentos que produzcan una cantidad mínima de desechos peligrosos (por ejemplo, aromáticos clorados, hidrocarburos, nitroaromáticos y productos farmacéuticos). Los estudios en los que se usan sustratos de alto costo (por ejemplo, compuestos de isótopos estables) también pueden encontrar uso en el sistema de reactor de tubo. También existen desventajas en el método del reactor tubular en comparación con los enfoques de mayor volumen. Algunos estudios pueden requerir volúmenes de muestra más grandes para múltiples análisis, lo que hace que el uso de un sistema de tasa de flujo tan bajo sea poco práctico.

Se encontró que el sistema particular que se analizó en este trabajo no estaba limitado por difusión y que el rango de concentración para cada tubo era pequeño. En este caso, se podría haber realizado un cálculo mucho más simple para determinar la tasa de reacción volumétrica efectiva en el reactor de biopelícula. Cuando la concentración en el volumen total del biofilm se puede considerar constante, se puede determinar una tasa de reacción promedio en el biofilm en cada tubo simplemente calculando el volumen del biofilm y dividiéndolo por la diferencia de concentración en el tubo. La suposición de concentración constante no se puede hacer para todos los sistemas, por lo que aquí se presentó el enfoque de modelado inverso más riguroso. En general, si las moléculas más grandes con coeficientes de difusión más bajos son objeto de un análisis cinético o si hay biopelículas más gruesas, aún se requerirá el método más riguroso.

La determinación de las velocidades de reacción específicas del biofilm es importante para el modelado preciso a microescala de los sistemas de biofilm. En este trabajo, se determinaron los coeficientes de tasa de hidrólisis de urea específicos de biopelículas (tanto Michaelis-Menten como modelos de tasa de primer orden) en un sistema de reactor tubular. Se encontró que para las condiciones químicas e hidrodinámicas presentes en este estudio, un modelo de velocidad de primer orden (lineal) se ajusta a los datos de velocidad de reacción versus concentración, así como al modelo de Michaelis-Menten, que es más difícil de trabajar computacionalmente. Este trabajo, junto con la caracterización previa de E. coli MJK2 en cultivo planctónico, convierte al organismo en una herramienta valiosa para el estudio de varios aspectos de la ureólisis en biopelículas. Las aplicaciones incluyen temas de investigación médica, ambiental y de ingeniería. Más allá de los hallazgos específicos relacionados con la ureólisis, el método presentado en este trabajo tiene aplicaciones más amplias para otras biopelículas donde es necesario determinar una velocidad de reacción específica de la biopelícula.

Morris NS, Stickler DJ, McLean RJ. El desarrollo de biopelículas bacterianas en catéteres uretrales permanentes. Mundo J Urol 1999; 17: 345–350.

Artículo CAS Google Académico

Zhao H, Thompson R, Lockatell V, Johnson DE, Mobley HLT. Uso de proteína fluorescente verde para evaluar la expresión del gen de la ureasa por Proteus mirabilis uropatógeno durante la infección del tracto urinario ascendente experimental. Infect Immun 1998; 66: 330–335.

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

De Muynck W, De Belie N, Verstraete W . Precipitación de carbonato microbiano en materiales de construcción: una revisión. Ecol Eng 2010; 36: 118–136.

Artículo Google Académico

Phillips AJ, Gerlach R, Lauchnor E, Mitchell AC, Cunningham AB, Spangler L. Aplicaciones de ingeniería de biomineralización ureolítica: una revisión. bioincrustaciones 2013; 29: 715–733.

Artículo CAS Google Académico

Yingjie Q, Cabral JMS. Propiedades y Aplicaciones de la Ureasa. Biocatal Biotransformación 2002; 20: 1–14.

Artículo Google Académico

Handley-Sidhu S, Sham E, Cuthbert MO, Nougarol S, Mantle M, Johns ML et al. Cinética de la precipitación de calcita mediada por ureasa y reducción de la permeabilidad de los medios porosos evidenciada por imágenes de resonancia magnética. Int J Environ Sci Technol 2013; 10: 881–890.

Artículo CAS Google Académico

Tobler DJ, Cuthbert MO, Greswell RB, Riley MS, Renshaw JC, Handley-Sidhu S et al. Comparación de las tasas de ureólisis entre Sporosarcina pasteurii y una comunidad indígena de aguas subterráneas en las condiciones requeridas para precipitar grandes volúmenes de calcita. Geochim Cosmochim Acta 2011; 75: 3290–3301.

Artículo CAS Google Académico

Wu Y, Ajo-Franklin JB, Spycher N, Hubbard SS, Zhang G, Williams KH et al. Monitoreo geofísico y modelado de transporte reactivo de la precipitación de carbonato de calcio impulsada por ureolítica. GeochemTrans 2011; 12: 1–20.

Artículo Google Académico

Ebigbo A, Phillips A, Gerlach R, Helmig R, Cunningham AB, Class H et al. Modelado a escala de Darcy de la precipitación mineral de carbonato inducida microbianamente en columnas de arena. Recursos Hídricos Res 2012; 48: W07519.

Artículo Google Académico

Redden G, Fox D, Zhang C, Fujita Y, Guo L, Huang H. Precipitación, transporte y detección de CaCO3 en medios porosos con generación in situ de reactivos. Medio Ambiente Sci Technol 2014; 48: 542–549.

Artículo CAS Google Académico

Moynihan HJ, Lee CK, Clark W, Wang NH. Hidrólisis de urea por ureasa inmovilizada en un reactor de lecho fijo: análisis y estimación de parámetros cinéticos. Biotecnología Bioeng 1989; 34: 951–963.

Artículo CAS Google Académico

Connolly J, Kaufman M, Rothman A, Gupta R, Redden G, Schuster M et al. Construcción de dos organismos modelo ureolíticos para el estudio de la precipitación de carbonato de calcio inducida microbianamente. J Microbiol Métodos 2013; 94: 290–299.

Artículo CAS Google Académico

Collins CM, Falkow S. Análisis genético de un locus de ureasa de Escherichia coli: evidencia de reordenamiento del ADN. J Bacteriol 1988; 170: 1041–1045.

Artículo CAS Google Académico

Folkesson A, Haagensen JAJ, Zampaloni C, Sternberg C, Molin S. Tolerancia inducida por biopelículas hacia los péptidos antimicrobianos. PLoS UNO 2008; 3: e1891.

Artículo Google Académico

Fidaleo M, Lavecchia R. Estudio cinético de la hidrólisis enzimática de urea en el rango de pH 4-9. Chem Biochem Eng Q 2003; 17: 311–319.

CAS Google Académico

Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frise E, Kaynig V, Longair M, Pietzsch T et al. Fiji: una plataforma de código abierto para el análisis de imágenes biológicas. Métodos Nacionales 2012; 9: 676–682.

Artículo CAS Google Académico

Zack GW, Rogers WE, Latt SA. Medición automática de la frecuencia de intercambio de cromátidas hermanas. J Histochem Cytochem 1977; 25: 741–753.

Artículo CAS Google Académico

Otsu N. Método de selección de umbral a partir del histograma de nivel de gris. IEEE Trans Syst Man Cybern 1979; 9: 62–66.

Artículo Google Académico

Clark S, Francis PS, Conlan XA, Barnett NW. Determinación de urea mediante cromatografía líquida de alta resolución con detección de fluorescencia tras derivatización automatizada con xanthidrol. J Chromatogr A 2007; 1161: 207–213.

Artículo CAS Google Académico

Stewart PD. Una revisión de las mediciones experimentales de permeabilidades de difusión efectivas y coeficientes de difusión efectivos en biopelículas. Biotecnología Bioeng 1998; 59: 261–272.

3.0.CO;2-9" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291097-0290%2819980805%2959%3A3%3C261%3A%3AAID-BIT1%3E3.0.CO%3B2-9" aria-label="Article reference 20" data-doi="10.1002/(SICI)1097-0290(19980805)59:33.0.CO;2-9">Artículo CAS Google Académico

Nelder J, Mead R. Un método simplex para la minimización de funciones. Computar J 1965; 7: 308–313.

Artículo Google Académico

Lagarias JC, Reeds JA, Wright MH, Wright PE. Propiedades de convergencia del método simplex de Nelder-Mead en dimensiones bajas. SIAM J Optim 1998; 9: 112–147.

Artículo Google Académico

Ferris FG, Phoenix V, Fujita Y, Smith RW. Cinética de la precipitación de calcita inducida por bacterias ureolíticas a 10 a 20 °C en aguas subterráneas artificiales. Geochim Cosmochim Acta 2003; 68: 1701–1710.

Artículo Google Académico

Zhang T, Clapper I. Modelo matemático de precipitación de calcita inducida por biopelículas. Agua Sci Technol 2010; 61: 2957-2964.

Artículo CAS Google Académico

Wildenschild D, Sheppard AP. Técnicas de análisis e imágenes de rayos X para cuantificar la estructura y los procesos a escala de poros en sistemas de medios porosos del subsuelo. Recursos de agua de Adv 2013; 51: 217–246.

Artículo Google Académico

Iltis GC, Armstrong RT, Jansik DP, Wood BD, Wildenschild D. Obtención de imágenes de la arquitectura del biofilm en medios porosos mediante microtomografía computarizada de rayos X basada en sincrotrón. Recursos hídricos Res 2011; 47: W02601.

Artículo Google Académico

Davit Y, Iltis G, Debenest G, Veran-Tissoires S, Wildenschild D, Gerino M et al. Obtención de imágenes de biopelículas en medios porosos mediante microtomografía computarizada de rayos X. J Microsc 2011; 242: 15–25.

Artículo CAS Google Académico

Seymour JD, Codd SL, Gjersing EL, Stewart PS. Microscopía de resonancia magnética de la estructura del biofilm e impacto en el transporte en un biorreactor capilar. J Magn Reson 2004; 167: 322–327.

Artículo CAS Google Académico

Graf von der Schulenburg DA, Vrouwenvelderb JS, Creber SA, van Loosdrecht MCM, Johns ML. Estudios de microscopía de resonancia magnética nuclear de bioincrustaciones de membranas. J Memb Sci 2008; 323:37–44.

Artículo CAS Google Académico

Fogler SA. Elementos de Ingeniería de Reacciones Químicas. 4ª ed. Prentice Hal, Upper Saddle River, Nueva Jersey, 2005.

Google Académico

Cussler EL. Difusión, Transferencia de Masa en Sistemas Fluidos. 3ra ed. Prensa de la Universidad de Cambridge: Cambridge, Reino Unido, 1997.

Google Académico

Stoodley P, Boyle JD, DeBeer D, Lappin-Scott HM. Evolución de las perspectivas de la estructura del biofilm. bioincrustaciones 1999; 14: 75–90.

Artículo Google Académico

Stoodley P, Dodds I, Boyle JD, Lappin-Scott HM. Influencia de la hidrodinámica y los nutrientes en la estructura del biofilm. J Appl Microbiol 1998; 85 Suplemento 1: 19S–28S.

Artículo Google Académico

Teodósio JS, Simões M, Melo LF, Mergulhão FJ. Hidrodinámica de celdas de flujo y sus efectos en la formación de biopelículas de E. coli en diferentes condiciones de nutrientes y flujo turbulento. bioincrustaciones 2011; 27: 1–11.

Artículo Google Académico

Ciurli S, Marzadori C, Benini S, Deiana S, Gessa C. Ureasa de la bacteria del suelo Bacillus pasteurii: inmovilización en Ca-poligalacturonato. Suelo Biol Biochem 1996; 28: 811–817.

Artículo CAS Google Académico

ASTM E2562. Método de prueba estándar para la cuantificación de biopelículas de Pseudomonas aeruginosa cultivadas con alto cizallamiento y flujo continuo utilizando el reactor de biopelículas de CDC. ASTM Internacional, 2007.

Lawrence JR, Swerhone GDW, Neu TR. Un reactor anular giratorio simple para estudios de biopelículas replicadas. J Microbiol Methods 2000; 42: 215–224.

Artículo CAS Google Académico

Goeres DM, Hamilton MA, Beck NA, Buckingham-Meyer K, Hilyard JD, Loetterle LR et al. Un método para hacer crecer una biopelícula bajo cizallamiento bajo en la interfaz aire-líquido utilizando el reactor de biopelícula de flujo por goteo. Protocolo Nacional 2009; 4: 783–788.

Artículo CAS Google Académico

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Los autores fueron financiados por la National Science Foundation a través del premio NSF No. DMS-0934696 y por los números de subvención del Departamento de Energía de EE. UU. DE-FG-02-09ER64758, DE-FE0004478, DE-FE0009599 y DE-FG02-13ER86571. JMC también recibió el apoyo de una beca NSF-IGERT en Sistemas Geobiológicos en la Universidad Estatal de Montana (DGE-0654336).

Centro de Ingeniería de Biopelículas, Universidad Estatal de Montana, Bozeman, MT, EE. UU.

James M. Connolly, Benjamin Jackson, Adam P. Rothman y Robin Gerlach

Departamento de Ingeniería Química y Biológica, Universidad Estatal de Montana, Bozeman, MT, EE. UU.

James M. Connolly, Adam P. Rothman y Robin Gerlach

Departamento de Ciencias Matemáticas, Universidad Estatal de Montana, Bozeman, MT, EE. UU.

benjamin jackson

Departamento de Matemáticas, Universidad de Temple, Filadelfia, Pensilvania, EE. UU.

isaac klapper

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JMC escribió el manuscrito. JMC y RG desarrollaron el diseño experimental. JMC y APR realizaron los experimentos. JMC desarrolló el modelo inverso que fue evaluado críticamente por BJ, IK y RG. El manuscrito fue editado por IK y RG y todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Robin Gerlach.

Los autores declaran no tener ningún interés financiero en competencia.

La información complementaria acompaña al documento en el sitio web de npj Biofilms and Microbiomes (http://www.nature.com/npjbiofilms)

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Reimpresiones y permisos

Connolly, J., Jackson, B., Rothman, A. et al. Estimación de una tasa de reacción específica de biopelícula: cinética de la hidrólisis de urea bacteriana en una biopelícula. npj Biofilms Microbiomas 1, 15014 (2015). https://doi.org/10.1038/npjbiofilms.2015.14

Descargar cita

Recibido: 26 noviembre 2014

Revisado: 26 de abril de 2015

Aceptado: 04 julio 2015

Publicado: 16 de septiembre de 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/npjbiofilms.2015.14

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