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Jun 15, 2023

Comparación de electrodos fractales y de rejilla para estudiar los efectos del confinamiento espacial en el comportamiento glial y neuronal retiniano disociado

Informes científicos volumen 12,

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 17513 (2022) Citar este artículo

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Comprender el impacto de la geometría y la composición del material de los electrodos en la supervivencia y el comportamiento de las células de la retina es importante tanto para los estudios celulares fundamentales como para las aplicaciones de neuromodulación. Investigamos cómo las células retinianas disociadas de ratones C57BL/6J interactúan con electrodos hechos de nanotubos de carbono alineados verticalmente que crecen en sustratos de dióxido de silicio. Comparamos electrodos con diferentes grados de confinamiento espacial, específicamente electrodos fractales y de rejilla con espacios conectados y desconectados entre los electrodos, respectivamente. Para ambos electrodos, encontramos que los procesos neuronales se acumulan predominantemente en el electrodo en lugar de las superficies de separación y que este comportamiento es más fuerte para los electrodos de rejilla. Sin embargo, el carácter 'cerrado' de los espacios entre electrodos de la rejilla impide que la glía cubra las superficies de los espacios. Se espera que esta falta de cobertura glial para las rejillas tenga efectos perjudiciales a largo plazo sobre la supervivencia neuronal y la actividad eléctrica. Por el contrario, los espacios interconectados dentro de los electrodos fractales promueven la cobertura glial. Describimos las diferentes respuestas celulares a los dos electrodos y planteamos la hipótesis de que existe una geometría óptima que maximiza la respuesta positiva tanto de las neuronas como de la glía cuando interactúan con los electrodos.

Hay un interés creciente en obtener una comprensión fundamental de los dispositivos artificiales diseñados para interactuar con las células del sistema nervioso humano. Cuando se implantan en el cuerpo, estos dispositivos tienen aplicaciones potencialmente importantes para el diagnóstico y tratamiento de muchas enfermedades neurodegenerativas, siendo la retinosis pigmentaria y la degeneración macular relacionada con la edad ejemplos comunes para el sistema visual1,2,3,4,5,6, 7. Para los dispositivos que cuentan con electrodos que estimulan las neuronas, el diseño de los electrodos también debe adaptarse a las interacciones con la glía. Aunque las neuronas y la glía se descubrieron más o menos al mismo tiempo, la investigación de estas últimas ha tardado más en ganar impulso8 a pesar de que prevalecen en el sistema nervioso central9 y desempeñan un papel central en el control de la estructura y la funcionalidad de la red neuronal10. Además de mejorar el rendimiento de los dispositivos médicos, la exploración de las diferencias entre las respuestas de estos dos tipos de células a los electrodos se puede utilizar para investigar el comportamiento fundamental de las células de la retina y el grado en que se puede controlar su comportamiento.

Las estrategias para controlar la presencia de glía deben equilibrar sus impactos positivos y negativos. La inserción de implantes y sus micromovimientos contra el tejido nervioso pueden desencadenar respuestas inflamatorias y de otro tipo de la glía11,12,13,14,15 junto con desajustes de sus propiedades mecánicas (como la rigidez) con el tejido16,17 . Estos efectos pueden crear "cicatrices" gliales que separan el electrodo de las neuronas objetivo y degradan su poder estimulante. Por otro lado, las técnicas destinadas a eliminar por completo la glía tendrán impactos negativos a largo plazo sobre la supervivencia neuronal, la salud y la actividad eléctrica18. Esto se debe a que la glía funciona como el sistema de soporte vital de las neuronas, brinda señales físicas naturales para su migración19,20,21 y ayuda a regular su función22, mantener su salud23 y mejorar su eficacia sináptica24.

Las estrategias para controlar las respuestas gliales se pueden implementar simultáneamente para crear el implante menos invasivo. Estos incluyen disminuir el tamaño del implante25, reducir los desajustes mecánicos17, mejorar la porosidad de la superficie26,27 y cubrir el implante con un revestimiento biomimético o bioactivo para ocultarlo potencialmente de la respuesta a cuerpo extraño13. Las modificaciones de la estructura física de la superficie, por ejemplo mediante la introducción de nanorrugosidad o la impresión de microcontactos mediante litografía, también se han utilizado para controlar la unión y la orientación de las células28,29,30 con muchos fines, incluida la reducción de las respuestas glióticas31.

Se ha investigado una amplia gama de estructuras con patrones nano/micro por sus interacciones con células gliales y neuronales27,29,31,32,33,34,35,36. El crecimiento neuronal se ve favorecido por superficies suaves y texturizadas37,38,39,40 a través de su gran parecido con la estructura de la matriz extracelular (MEC)41,42. Por el contrario, la cobertura glial debida al crecimiento y la división celular se amortigua en sustratos texturizados y más blandos como resultado de interacciones superficiales debilitadas17,32,43,44,45,46,47. De acuerdo con estos resultados, un experimento que empleó un cultivo conjunto de células demostró que las neuronas se acumulan en filas de nanocables mientras que la glía se acumula en las regiones planas entre ellos31. A pesar de todos estos esfuerzos, los mecanismos que controlan las interacciones de diferentes tipos de células con diversas superficies aún no se conocen por completo.

Nuestro estudio se centra en la importancia de la geometría de los electrodos en combinación con las propiedades del material de los electrodos para controlar la respuesta glial y el comportamiento neuronal asociado. Empleamos nanotubos de carbono prístinos como material conductor del electrodo según nuestras pruebas anteriores con neuronas retinianas y glía48. Además, estudios previos han destacado su capacidad para disminuir la formación de tejido cicatricial glial49 y han demostrado su capacidad para estimular las neuronas de manera efectiva50,51,52 y aumentar la transmisión de señales53,54,55,56.

Al hacer crecer nanotubos de carbono alineados verticalmente (VACNT) en un sustrato de dióxido de silicio (SiO2), generamos regiones con patrones laterales de electrodos texturizados (VACNT) y espacios suaves (SiO2). Según los estudios anteriores de las respuestas celulares a las diferentes texturas, las regiones VACNT están diseñadas para acumular predominantemente neuronas, mientras que las regiones suaves de SiO2 acumulan glía. A través de este diseño, las regiones VACNT sirven como andamiaje para las neuronas normalmente proporcionadas por la glía en la retina. Al acumularse en los huecos de este andamio, la glía estará lo suficientemente cerca para proporcionar soporte trófico y metabólico a las neuronas en los electrodos sin bloquear físicamente las interacciones neurona-electrodo necesarias para una estimulación máxima. Con una altura aproximada de 25 µm, los electrodos VACNT actúan como barreras para la glía y, por lo tanto, presentan el potencial de guiar la cobertura de la glía a través de la superficie de SiO2. Nuestro estudio investiga el impacto del confinamiento en el comportamiento celular al considerar un sistema 'cerrado', en el que los electrodos VACNT forman una serie de espacios que están desconectados entre sí por las paredes restrictivas, y un sistema 'abierto' en el que los electrodos están rodeado de lagunas conectadas.

En lugar de realizar un estudio exhaustivo de varios diseños "cerrados" y "abiertos", aquí nos centramos en dos ejemplos que son adecuados para aplicaciones de electrodos y demostramos algunos comportamientos celulares fundamentales que son útiles para informar futuros diseños de electrodos. Con este objetivo, los electrodos de rejilla y fractales sirven como ejemplos atractivos de estos dos diseños. Ambos se han considerado previamente para electrodos que interactúan con neuronas y/o glía57,58,59,60,61,62,63,64,65. Para cada geometría, los VACNT forman redes continuas que facilitan la polarización de los electrodos (Información complementaria). Además, se predice que las grandes capacitancias eléctricas generadas por sus geometrías mejorarán la estimulación neuronal57 y ambas permitirán la transmisión de luz a través de sus espacios. Sin embargo, estas propiedades solo son beneficiosas si van acompañadas de respuestas celulares favorables. Nuestro estudio de las rejillas se basa en una investigación pionera de 1978 que muestra que la glía generada a partir de una biopsia de cerebro humano podría estar confinada dentro de las cámaras de un patrón de rejilla metálica65. Este sistema 'cerrado' presentaba una serie de cámaras desconectadas de ~ 100 µm de ancho. Aquí fabricamos cámaras de tamaño similar de 60 μm de ancho, que son lo suficientemente grandes como para acomodar varios procesos y cuerpos de células gliales. Sin embargo, mientras que el estudio original presentaba un cultivo solo de glía, empleamos un cultivo conjunto para permitir la investigación de las interacciones entre la glía y las neuronas. El ancho del electrodo VACNT se elige para que sea WCNT = 20 µm. Este ancho permite que los somas de varias neuronas se adhieran a las superficies VACNT y que sus procesos crezcan desde los somas a lo largo de la superficie del electrodo.

En términos de nuestra elección del sistema 'abierto', las ramas fractales prevalecen en la naturaleza66,67,68. Además de las plantas, los árboles69 y los ríos70, las redes bronquiales71, cardiovasculares69 y neuronales72 presentan ramas fractales. Sus ramas se extienden en el espacio, produciendo dos patrones fractales incrustados, las ramas y los espacios que se forman entre ellas, y su relación estructural puede conducir a una funcionalidad mejorada. En particular, las brechas de múltiples escalas forman un sistema interconectado que interactúa de manera eficiente con las ramas penetrantes. Mientras que, por ejemplo, esta interacción entre la brecha y la rama facilita la exposición a la luz para los árboles73 y la transferencia de oxígeno para los árboles bronquiales74, un estudio reciente realizado por los autores investigó las interacciones de las neuronas gliales con electrodos fractales fabricados a partir de VACNT59. Nuestros electrodos cuentan con una geometría 'H-Tree' que se repite en múltiples escalas (Fig. 1). Para facilitar una comparación con las rejillas, el ancho del electrodo VACNT se elige para que sea de 20 µm y el ancho de espacio más pequeño (consulte la información complementaria) de 60 µm coincide con el ancho de la cámara de los electrodos de la rejilla. Este tamaño permite que la glía se conecte a espacios cada vez más grandes dentro del electrodo fractal, que pueden verse como un conjunto de cámaras interconectadas.

Los diseños de máscara de litografía y las imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de la rejilla y los electrodos fractales. ( a, b ) Máscaras binarias de los electrodos de rejilla y fractal respectivamente. ( c, d ) el zoom de los cuadros rojos en ( a ) y ( b ) que muestran algunos de los parámetros geométricos de los dos electrodos (consulte la sección "Materiales y métodos" y la Información complementaria para conocer las definiciones). ( e, f ) Imágenes SEM de VACNT en una región equivalente a los cuadros rojos en ( a ) y ( b ) para la rejilla y los electrodos fractales, respectivamente. Los tamaños de máscara en (a) y (b) están a escala (consulte la Tabla 1 para ver los tamaños relativos). Las barras de escala en (e) y (f) son 50 y 200 μm, respectivamente.

Consideramos los experimentos in vitro que utilizan un cocultivo de neuronas retinianas de ratón disociadas y glía porque proporciona un entorno controlado en el que se puede utilizar la microscopía de fluorescencia para examinar el comportamiento celular y las interacciones célula-electrodo a medida que evolucionan durante 17 días in vitro (DIV) . Usando observaciones cualitativas y cuantitativas, encontramos que los electrodos de rejilla atrapan la glía dentro de las cámaras desconectadas, impidiendo que cubran las regiones lisas de SiO2. Por el contrario, los electrodos fractales brindan a la glía la oportunidad de dividirse y crecer y así cubrir gradualmente regiones conectadas de SiO2 cada vez más grandes. Si bien ambos electrodos respaldan la adhesión, el crecimiento y la supervivencia de las neuronas, encontramos que los electrodos de rejilla promueven la mayor densidad de procesos neuronales en las superficies VACNT y SiO2 en comparación con los electrodos fractales. Su geometría 'cerrada' aumenta la proximidad de las neuronas a los bordes de interfaz entre las dos superficies. Estos bordes sirven como puntos de anclaje para los somas neuronales y fomentan que sus procesos crezcan y se conecten con otras neuronas. Discutiremos las consecuencias de esta interacción de los dos tipos de células para la salud y la estimulación celular.

Fabricamos geometrías de H-Tree basadas en el número de niveles repetidos m = 5 y una dimensión fractal de D = 2 que establece la tasa de contracción entre estos niveles (consulte la Información complementaria para obtener una explicación más detallada de m, D y el parámetros geométricos relacionados discutidos en esta sección)59. Cuando se combinan con WCNT = 20 µm y WSi-min = 60 µm, estos parámetros generan una distancia máxima de separación de electrodos de WSi-max = 3,22 × 103 µm y un ancho total del electrodo de W = 6,26 × 103 µm (Tabla 1, Fig. Suplementaria). .S1). El WCNT para las rejillas se fijó igual a los fractales y el ancho total de los electrodos se fijó en W = 3,51 × 103 µm (correspondiente a 43 cámaras por fila) para proporcionar aproximadamente la misma longitud de borde total, E, y aproximadamente la misma área de cobertura , ACNT, como el electrodo fractal. E se estandarizó porque representa el límite de interacción entre los electrodos ricos en neuronas y los espacios ricos en glía. ACNT también se estandarizó para garantizar cantidades similares de material VACNT, así como áreas transversales similares para ambos electrodos durante las interacciones iniciales con las células. Notamos que, debido a que los dos electrodos pertenecen a geometrías fundamentalmente diferentes (fractales de múltiples escalas versus cuadrículas 'euclidianas' de una sola escala), no es posible controlar todos sus parámetros; en consecuencia, los dos electrodos difieren en sus límites. áreas, Abundante, y áreas superficiales de SiO2, ASi. También observamos que todos los parámetros geométricos fractales se calcularon en función de D, m, W y WCNT y, por lo tanto, son interdependientes. La Tabla 1 resume los diversos parámetros de los dos diseños de electrodos.

Se utilizaron técnicas de microfabricación y litografía para sintetizar los electrodos de cuadrícula y fractal VACNT siguiendo procedimientos que se han descrito en detalle en otro lugar48. Brevemente, se limpiaron y moldearon obleas de silicio de 2 pulgadas con una capa superior de óxido térmico (SiO2) de 300 nm utilizando técnicas de fotolitografía. La oblea completa contenía 10 rejillas individuales y 8 electrodos fractales individuales. Después del desarrollo de la fotoprotección, se depositó térmicamente una capa adhesiva de aluminio (Al) de 2 a 5 nm seguida de una deposición por haz de electrones de una capa de catalizador de hierro (Fe) de 3 a 5 nm. Después de 30 s de remojo en acetona acompañado de sonicación para levantar la capa fotorresistente, la oblea se cortó en muestras individuales con cada muestra con un electrodo. No todas las muestras fabricadas se usaron en los experimentos de cultivo de células disociadas. Algunas muestras se eliminaron debido a defectos visibles o se guardaron para su posterior caracterización SEM. Se utilizaron técnicas de deposición química de vapor (CVD) para sintetizar VACNT en los patrones de catalizador en un tubo de cuarzo de 2 pulgadas. Una mezcla 2:1 de etileno (C2H4):hidrógeno (H2) (200 y 100 SCCM respectivamente) acompañada de un flujo de 600 SCCM de Argón (Ar) se mantuvo durante el tiempo de crecimiento de 3 min a 650 °C. Esta técnica dio como resultado electrodos estampados que consisten en 'bosques' entrelazados de VACNT (Fig. 1, Fig. S2 complementaria). A continuación, los electrodos se almacenaron en bandejas de circuitos integrados en un armario desecador. La superficie superior y las paredes laterales de los VACNT, sus alturas y condiciones generales se inspeccionaron con un microscopio electrónico de barrido ZEISS-Ultra-55. No se observaron diferencias visuales entre las muestras de los dos diseños de electrodos y las ejecuciones de fabricación. Las alturas de VACNT estaban en el rango de 16 a 36 µm. Durante el cultivo, las muestras se colocaron en placas de cultivo de 4 pocillos (Sarstedt, Newton, NC) con una muestra por pocillo.

Los ratones C57BL/6J de tipo salvaje se mantuvieron en los servicios de bienestar animal de la Universidad de Oregón (UO) con acceso permanente a agua dulce y suministros de alimentos. Los procedimientos de manejo y cultivo que involucraron a los ratones se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la UO bajo el protocolo 16-04, de conformidad con las pautas ARRIVE y las pautas de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales experimentales. animales Se emplearon cultivos de células retinales disociadas utilizando los protocolos descritos en otros lugares31,48,75. Brevemente, los ratones del día 4 postnatal (PN4) fueron sacrificados por decapitación y sus retinas se diseccionaron rápidamente y se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM—ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) que contenía alto contenido de glucosa, piruvato de sodio, l-glutamina y rojo fenol. . Para cada experimento de cultivo, se transfirieron cuatro retinas a una solución enzimática que contenía DMEM, papaína (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ) y l-cisteína (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Las retinas digeridas se enjuagaron cuidadosamente con DMEM y se transfirieron a DMEM nuevo que contenía B27 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) y l-glutamina-penicilina-estreptomicina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). La solución de retina disociada se centrifugó y el sedimento celular se resuspendió en la solución de DMEM/B27/antibiótico. La suspensión de células (500 µl) se sembró posteriormente en cada pocillo que contenía una rejilla o un electrodo fractal. Las células se cultivaron durante 17 DIV a 37 °C y 5 % de CO2. El medio de cultivo se cambió primero a las 3 DIV y luego cada dos días hasta el final del tiempo de cultivo. No se utilizaron protocolos como el recubrimiento previo de las superficies con poli-d-lisina (PDL) o poli-l-lisina (PLL) para aumentar la adhesión neuronal y glial a los diferentes tipos de superficies. La densidad de células vivas medida por un hemocitómetro fue (3,7 ± 0,4) × 106 células/mL.

El protocolo de inmunocitoquímica se describe en detalle en otra parte31,48,75. Brevemente, las células se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4 %, se enjuagaron con una solución tamponada de fosfato (PBS) y se preincubaron en PBS completo, que contenía PBS, Triton-X (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), bovino. albúmina sérica (BSA) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), suero normal de cabra y suero normal de burro (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Posteriormente, las células se incubaron con PBS-completo que contenía los anticuerpos primarios, anti-β-tubulina III de ratón (marcador neuronal para varios tipos de neuronas en la retina de ratón76,77—Sigma-Aldrich, St Louis, MO) y anti-fibrilar glial de conejo. proteína ácida (GFAP; marcador de glía: Agilent, Santa Clara, CA) durante la noche a 4 °C. A continuación, las células se enjuagaron y se incubaron con PBS completo que contenía los anticuerpos secundarios IgG anti-ratón de cabra Cy3 y IgG anti-conejo de burro AlexaFluor 488 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). A continuación, se eliminó la solución de anticuerpo secundario y se enjuagaron las células con PBS. Las muestras se transfirieron a portaobjetos de microscopio y se montaron con Vectashield que contenía DAPI (marcador nuclear de células fluorescentes que se une al ADN—Vector Laboratories, Burlingame, CA).

Se utilizó un microscopio de fluorescencia invertido Leica DMi8 para tomar imágenes de 20x en el Cy3 (excitado a 550 nm, pico de emisión a 570 nm), AlexaFluor 488 (excitado a 493 nm, pico de emisión a 519 nm) y DAPI (excitado a 358 nm). , pico de emisión a 461 nm) canales para todos los electrodos. Las superficies superior VACNT e inferior SiO2 se tomaron imágenes por separado con el enfoque ajustado a estas superficies. El campo de visión (FOV) de 2048 × 2048 píxeles2 (662,65 × 662,65 µm2) en cada canal se unió luego mediante un algoritmo de unión automatizado con un 10 % de superposición en los bordes de los FOV vecinos para crear imágenes de electrodos completos.

Elegimos el crecimiento del proceso neuronal como la medida del fenotipo morfológico de la función y la salud de las células neuronales78,79. Esto se basó en parte en el objetivo a largo plazo de emplear electrodos para la estimulación de neuronas y la alta densidad de sitios de estimulación en los procesos. El análisis cuantitativo implicó un cálculo de la densidad de los procesos (es decir, la longitud total de las dendritas y axones de las neuronas dentro de un área de superficie dada). En función de su función de promover la homeostasis y la supervivencia de las neuronas, el análisis glial se centró en cuantificar el área de superficie que expresa el marcador citoesquelético GFAP32. Este análisis involucró un cálculo de la densidad de cobertura de su superficie (referida en lo sucesivo como 'cobertura', es decir, el área de superficie cubierta por glía normalizada al área de superficie total disponible).

Para realizar este análisis cuantitativo59, se crearon máscaras binarias usando un algoritmo de MATLAB para los electrodos fractales y de rejilla basados ​​en el WCNT medido usando el canal DAPI de las imágenes de fluorescencia. Luego, estas máscaras se aplicaron a todos los FOV aceptables para cada electrodo para que las superficies de SiO2 y VACNT pudieran analizarse por separado. Los FOV inaceptables (p. ej., aquellos con cualquier anomalía, como deformaciones VACNT) fueron raros: típicamente 2 de 50 FOV. Se integró un algoritmo MATLAB de análisis de imágenes automatizado con el algoritmo de máscara binaria para detectar y medir la longitud del proceso por FOV en las superficies SiO2 y VACNT por separado. En los casos en que los procesos se superpusieron físicamente (por ejemplo, cuando se "agruparon" y siguieron una ruta común en la superficie o cuando varios procesos siguieron el mismo borde del electrodo), el algoritmo los detectó como un solo proceso. Esto resultó en un recuento insuficiente de procesos, especialmente en las superficies VACNT, pero no afectó los resultados generales de los experimentos. Para cada electrodo, la longitud normalizada del proceso en las superficies SiO2 (NSi) y VACNT (NCNT) se definió como la longitud total del proceso en cada superficie en todos los FOV (NLSi o NLCNT) dividida por el área total de esa superficie en el electrodo (ASi o ACNT):

Para la glía, se utilizó un algoritmo MATLAB de umbral semiautomático integrado con el algoritmo de máscara binaria para detectar y medir el área glial por FOV en las superficies SiO2 y VACNT por separado. Para cada electrodo, el área glial normalizada en las superficies SiO2 y VACNT se definió como el área glial total en cada superficie en todos los FOV (GASi o GACNT) dividida por el área total de esa superficie:

Para minimizar el error en la detección de la longitud del proceso neuronal y el área glial alrededor de los bordes de los electrodos en ambas superficies, se inspeccionaron los campos de visión y las medidas de la máscara se ajustaron manualmente si fue necesario para permitir la detección correcta de las características enfocadas (consulte la Fig. S3 complementaria). para ver ejemplos de cobertura glial y algoritmos de detección de procesos neuronales en la superficie VACNT de electrodos fractales).

Se realizó la prueba de Shapiro-Wilk para determinar la normalidad de los parámetros neuronales y gliales. Debido a que algunas de las distribuciones fallaron en los criterios de normalidad, la comparación no paramétrica de Kruskal-Wallis para la significación (con un nivel de significancia de 0.05) se usó en MATLAB para comparar las medianas de los parámetros neuronales y gliales contra varias hipótesis nulas (por ejemplo, GSi y GCNT fueron probado contra la hipótesis nula de que el material de la superficie no afectaría el comportamiento glial). Los valores atípicos se determinaron como cualquier punto de datos que estaba por debajo del mínimo establecido como Q1-1.5IQR o por encima del máximo establecido como Q3 + 3IQR, donde Q1, Q3 e IQR representan el cuartil 25%, el cuartil 75% y el rango intercuartílico ( Q3–Q1) respectivamente. En los experimentos se utilizaron un número total de 7 electrodos de rejilla de 3 cultivos independientes y 11 electrodos fractales de 5 cultivos independientes. Algunas muestras fueron excluidas debido a complicaciones en los procedimientos de fabricación o cultivo. Cada cultura independiente incluyó ambos diseños de electrodos.

Primero, nos enfocamos en algunas observaciones cualitativas del comportamiento celular. La figura 2 y la figura complementaria S4 muestran imágenes de fluorescencia representativas de las interacciones de las células con los electrodos. Se observaron glia en las superficies SiO2 y VACNT de ambos electrodos a 17 DIV. La glía que reside en el SiO2 nunca extendió los procesos sobre las superficies VACNT. En términos de morfología, la glía exhibió una forma extendida con múltiples procesos largos bien definidos en las superficies de SiO2 de ambos electrodos. Por el contrario, tenían una morfología más alargada en las superficies VACNT de ambos electrodos. Estos siguieron la forma de las superficies VACNT y, aunque son raros, incluso hicieron giros de 90° en los puntos de inflexión VACNT.

Ejemplos representativos de imágenes de fluorescencia de células retinianas que interactúan con la rejilla y los electrodos fractales a 17 DIV (verde = glía marcada con GFAP; rojo = neuronas marcadas con β-tubulina III; azul = núcleos marcados con DAPI). Glia en las superficies VACNT de (a) rejilla y (b) electrodos fractales. La glía se acumula en las superficies de SiO2 de la (c) rejilla y (d) los electrodos fractales. La estructura de la glía en las superficies VACNT de la rejilla (e) y los electrodos fractales (f), así como las superficies de SiO2 de la rejilla (g) y los electrodos fractales (h). Procesos neuronales siguiendo los electrodos VACNT de (i) rejilla y (j) electrodos fractales. ( k ) Grupos de neuronas dentro de las cámaras de rejilla que envían procesos hacia las paredes laterales VACNT. (l) Grandes grupos de neuronas en la superficie de SiO2 que se conectan a las neuronas en la superficie VACNT de un electrodo fractal. Procesos neuronales siguiendo los electrodos VACNT de la rejilla (m) y los electrodos fractales (n). (o) Grupo de neuronas unido a la pared lateral VACNT de una cámara de rejilla que envía procesos a las superficies SiO2 y VACNT. (p) Grupos de neuronas y procesos de conexión en las superficies SiO2 y VACNT de un electrodo fractal. Las imágenes en (c) y (k) muestran el mismo FOV, al igual que (d) y (l). Los bordes de los electrodos se resaltan con líneas blancas excepto para los paneles (i), (j), (m) y (n) que se concentran en el comportamiento de los procesos a lo largo de los bordes porque las líneas habrían oscurecido estos procesos. Las barras de escala son: 10 µm en (e) y (f); 20 µm en (g), (h), (m), (n) y (o); 40 µm en (p); 50 µm en (a), (b), (c), (i), (j) y (k); y 100 µm en (d) y (l).

Las neuronas se adhirieron y desarrollaron procesos en las superficies SiO2 y VACNT de los electrodos fractales y de rejilla. Para ambas superficies, los somas neuronales a veces se agrupaban y algunos de los procesos que conectaban los grupos formaban haces. Este comportamiento se observó con más frecuencia en la superficie de SiO2 que en la superficie VACNT (Fig. 2i–l). Las neuronas en las dos superficies se conectaron a través de grupos unidos a las paredes laterales de VACNT y los procesos se observaron con frecuencia siguiendo los bordes superior e inferior de las paredes laterales (Fig. 2, Fig. S4 complementaria). Los grandes grupos en las superficies de SiO2 eran mucho más comunes para el fractal que para los electrodos de rejilla, particularmente en regiones acompañadas por una gran cobertura glial. Ocasionalmente, se evidenciaron grandes cúmulos en algunas cámaras de rejilla y esto ocurrió con mayor frecuencia cuando había presencia de glía. Por ejemplo, en la Fig. 2c y k, el grupo en la cámara central (que no tiene glía) parece ser más pequeño que los de las cuatro cámaras circundantes (que están ocupadas por glía).

Pasamos ahora a las medidas cuantitativas. En primer lugar, se estudió el efecto del sistema material SiO2-VACNT sobre las distribuciones gliales y neuronales en las dos superficies mediante una comparación estadística de GSi frente a GCNT y NSi frente a NCNT para los electrodos de rejilla y fractal por separado. No hubo una diferencia significativa entre GSi y GCNT para las cuadrículas (Fig. 3a), mientras que GSi fue significativamente mayor para los fractales (p = 0,0002, Fig. 3c). NSi fue significativamente más bajo que NCNT tanto para las cuadrículas como para los fractales (p = 0.0017 y 0.0053 respectivamente, Fig. 3b, d).

Comparación del comportamiento glial y neuronal en las superficies SiO2 y VACNT para los electrodos de rejilla y fractal a 17 DIV. Análisis estadístico que muestra diagramas de caja de GSi (izquierda) en comparación con GCNT (derecha) para las cuadrículas (a) y (c) fractales, así como NSi (izquierda) en comparación con NCNT (derecha) para las cuadrículas (b) y (d) fractales. Los ejes y de (a) y (c) muestran el rango de valores de GSi y GCNT y los ejes y de (b) y (d) muestran el rango de valores de NSi y NCNT. Las estrellas en los paneles (b–d) indican los grados de importancia: *** y ** denotan p ≤ 0,001 y p ≤ 0,01, respectivamente. El signo más rojo en el panel (d) es un valor atípico. Tenga en cuenta que GSi y GCNT no tienen unidades y NSi y NCNT tienen unidades de μm−1 (consulte la sección "Materiales y métodos").

Habiendo evaluado el efecto de las regiones SiO2 y VACNT en las distribuciones gliales y neuronales para cada diseño de electrodo por separado, comparamos el éxito de los dos electrodos para lograr las distribuciones celulares deseadas (es decir, concentrar las neuronas y la glía en las regiones VACNT y SiO2, respectivamente). Las Figuras 4a yb muestran diagramas de dispersión de GSi frente a GCNT y NCNT frente a NSi para la rejilla y los electrodos fractales. Las líneas negras representan las condiciones GSi = GCNT y NCNT = NSi. Todos los fractales lograron con éxito la condición GSi > GCNT, mientras que solo 2 de las 7 cuadrículas lo lograron. Por otro lado, todas las cuadrículas lograron alcanzar la condición NCNT > NSi, mientras que 9 de los 11 fractales lograron hacerlo. Las líneas sólidas rojas y azules se ajustan hasta cero para las cuadrículas y los fractales y se incluyen como guías para el ojo. Aunque estas guías lineales son útiles para comparar los datos con las condiciones GSi = GCNT y NCNT = NSi (representadas por las pendientes de las líneas negras), no estamos utilizando estos ajustes para implicar un comportamiento estrictamente lineal (los valores de R2 son iguales a 0,06 para la cuadrícula y 0,32 para los ajustes fractales GSi versus GCNT, y 0,71 para la cuadrícula y 0,41 para los ajustes fractales NCNT versus NSi).

Estudio de la relación de GSi con GCNT y NCNT con NSi para los electrodos de rejilla y fractal. (a) Diagrama de dispersión de GSi frente a GCNT para las cuadrículas (rojo) y los fractales (azul). (b) Diagrama de dispersión de NCNT frente a NSi para las cuadrículas (rojo) y los fractales (azul). Las líneas negras continuas representan las condiciones GSi = GCNT y NCNT = NSi en (a) y (b), respectivamente. Las líneas sólidas rojas y azules se ajustan a cero para las cuadrículas y los fractales, respectivamente.

Finalmente, los electrodos de rejilla y fractal se compararon directamente para cada uno de los cuatro parámetros (GSi, GCNT, NSi y NCNT). En términos de comportamiento glial, los resultados de las comparaciones estadísticas confirmaron que los fractales tenían un GSi significativamente más alto que las cuadrículas (p = 0,0018, Fig. 5a), mientras que las cuadrículas tenían un GCNT significativamente más alto que los fractales (p = 0,0164, Fig. 5b) . Teniendo en cuenta el comportamiento neuronal, las cuadrículas tenían NSi y NCNT significativamente más altos en comparación con los fractales (p = 0.0333 y 0.0013, respectivamente, Fig. 5c, d). El valor atípico fractal en las Figs. 3d y 5c tienen el NSi más bajo probablemente debido a que tiene el valor de GSi más bajo entre todos los fractales (este GSi bajo se debió a variaciones entre diferentes electrodos dentro de una cultura).

Comparación entre la rejilla y los electrodos fractales a 17 DIV en términos del comportamiento glial y neuronal en las superficies SiO2 y VACNT. Análisis estadístico que muestra diagramas de caja de (a) GSi, (b) GCNT, (c) NSi y (d) NCNT entre la rejilla y los electrodos fractales. Las estrellas en todos los paneles indican los grados de significación: ** y * denotan p ≤ 0,01 y p ≤ 0,05, respectivamente. El signo más rojo en el panel (c) es un valor atípico.

Nuestros experimentos se basaron en el comportamiento bien establecido de que la glía se acumula en superficies lisas en lugar de texturadas31,44,45,48. Mientras que la mayoría de los estudios anteriores investigaron cultivos gliales puros en sustratos hechos de un solo material con diferentes texturas, aquí nos enfocamos en cocultivos de neurona retiniana y glía en un sistema de múltiples materiales (SiO2 suave y VACNT texturizado) para confirmar que diferentes tipos de células dentro de un co-cultivo se podría hacer que se acumule en diferentes regiones mediante la manipulación de la textura de la superficie31. Para lograr esto, combinamos patrones laterales a escala micrométrica de las VACNT (con una altura promedio de 25 µm) con sus efectos de nanorrugosidad superficial, en contraste con estudios previos que usaron superficies nanorrugosas sin patrón32,45,49, nanorrugosidad. ondulaciones y microranuras46, y nanocables31. Encontramos que, como era de esperar, las morfologías celulares observadas en las dos superficies eran consistentes con las observadas en los estudios texturales previos32,59. Sin embargo, se demostró que las grandes alturas de VACNT son un factor importante en el diseño de nuestro sistema: la glía que reside en el SiO2 nunca extendió los procesos sobre las superficies de VACNT. Como tales, los electrodos VACNT actuaron como barreras para la glía y, por lo tanto, guiaron la cobertura de la glía a través de la superficie de SiO2. Teniendo en cuenta el impacto del tamaño del espacio en el comportamiento glial, el tamaño más pequeño del espacio en el diseño fractal, WSi-min, no impidió que la cobertura glial se extendiera entre los espacios fractales, como sugiere la morfología extendida de la glía ubicada en el WSi-min. brechas (Fig. 2d, Fig. S4 complementaria). Por lo tanto, las regiones de SiO2 más pequeñas dentro del electrodo fractal se conectaron a áreas cada vez más grandes, lo que proporcionó a la glía la libertad de expandir su cobertura a través de estas grandes regiones (Figura complementaria S4). Aunque el tamaño de las cámaras de la rejilla coincidía con el WSi-min de los electrodos fractales, el carácter desconectado de los electrodos de la rejilla impedía que la glía que residía en una cámara accediera a otras regiones del electrodo (Fig. 2c). Esto dejó regiones dentro del electrodo de rejilla desprovistas de glía y dio como resultado que las rejillas tuvieran valores de GSi significativamente más bajos que los electrodos fractales (Fig. 5a). Esto puede tener efectos negativos significativos en la supervivencia y función de las neuronas a largo plazo, ya que es bien sabido que la glía actúa como sistema de soporte vital de las neuronas80,81 y su presencia mejora significativamente las conexiones sinápticas entre neuronas82.

Teniendo en cuenta el comportamiento neuronal en las superficies de SiO2, las neuronas dependen de la adhesión a la superficie para su desarrollo y supervivencia. Debido a su mayor proximidad a las paredes laterales de VACNT, las neuronas en las cámaras de la rejilla tenían una mayor probabilidad de adherirse y hacer crecer sus procesos a lo largo de los bordes de los electrodos que aquellas en los espacios fractales más grandes. Esta atracción de procesos a las paredes laterales en lugar de a las superficies de SiO2 podría haber sido alentada aún más por señales químicas (factores neurotróficos)83,84,85,86 de las neuronas y glía en las superficies VACNT, lo que podría reducir el NSi para las rejillas en comparación con el fractales. Sin embargo, planteamos la hipótesis de que dominó otro comportamiento relacionado con la adhesión, lo que provocó que NSi fuera el más bajo para los fractales. Las fuertes fuerzas de adhesión célula-VACNT experimentadas por las neuronas habrían competido con las fuerzas de agregación neurona-neurona, ralentizando la formación de grupos en las cámaras de la rejilla. Por el contrario, es menos probable que las neuronas en los espacios fractales se encuentren con los bordes VACNT, lo que resulta en una mayor tendencia a la agregación de sus somas en grupos más grandes. La presencia de glía también promovió este patrón de agregación. Durante la agregación, los procesos que conectaban los grupos más grandes disminuyeron, y algunos se unieron para formar paquetes que luego contribuyeron a la disminución de NSi porque el algoritmo de detección de procesos normalmente contaba cada paquete como un enlace entre grupos (consulte la sección "Materiales y métodos"). Este comportamiento de agrupamiento incluso dejó muchas ubicaciones en los espacios fractales completamente vacías de procesos. Por lo tanto, es posible que el predominio de este segundo patrón dependiente de la adhesión pueda explicar los valores de NSi significativamente más bajos para los espacios fractales en comparación con las cámaras de rejilla (Fig. 5c).

En consonancia con los resultados anteriores48,53, las superficies VACNT respaldaron un crecimiento del proceso neuronal que fue mayor en comparación con las superficies de SiO2 para los electrodos fractales y de rejilla (Fig. 3b, d). La nanorrugosidad de CNT imita algunas de las propiedades de la ECM, lo que proporciona un crecimiento del proceso neuronal guiado y una mejor adhesión neuronal41,42. Además, proporcionan una flexibilidad mecánica favorable que puede mejorar el proceso de crecimiento y ramificación de las neuronas87, estableciendo así un entorno adecuado para la adhesión, la supervivencia y el crecimiento neuronales sin necesidad de ninguna modificación química adicional de la superficie48. Esto dio como resultado valores de NCNT significativamente mayores que de NSi tanto para la rejilla (Fig. 3b) como para los electrodos fractales (Fig. 3d). Debido a su sensibilidad a las señales topográficas31,33,88,89, los procesos mostraron una tendencia a seguir los bordes superior e inferior de las paredes laterales de VACNT para ambos electrodos (Fig. 2i, j, Fig. S4 complementaria). La gran longitud del borde conectado de ambos diseños de electrodos brindó la oportunidad de que se formaran grupos y se anclaran a las paredes laterales del VACNT. Los valores más grandes de NCNT para las rejillas en comparación con los fractales (Fig. 5d) probablemente se explican por las mayores posibilidades de que los grupos anclados a las paredes laterales de VACNT de la rejilla faciliten mayores conexiones entre los procesos en las cámaras y aquellos en las superficies VACNT (Fig. 2o y Fig. S4 complementaria).

Ahora consideramos por qué GCNT es más alto para las cuadrículas que para los fractales. Esto es desconcertante porque los dos electrodos tienen valores ACNT similares y las superficies VACNT dificultan la división y el crecimiento celular59. Según estas consideraciones, esperaríamos que la GCNT fuera similar para los dos electrodos. Aunque es especulativo, las superficies VACNT ricas en neuronas de la red podrían haber cambiado el destino de algunas de las células progenitoras retinales existentes en el medio ambiente90,91 para convertirse en glía. Se sabe que, in vivo, las células madre/progenitoras neuronales tienen la capacidad de diferenciarse en diferentes tipos de células neuronales92 dependiendo de las señales físicas, bioquímicas y topográficas presentes en su entorno93 y quizás este efecto se extienda a nuestro entorno in vitro62,94. En consecuencia, los valores de NCNT más grandes para las cuadrículas sobre los fractales (Fig. 5d) podrían haber inducido sus valores de GCNT más grandes (Fig. 5b). Esta relación entre las neuronas y la glía en las superficies VACNT de las rejillas se sugiere además en la Fig. 6.

Estudio de la relación de GCNT con NCNT para los electrodos de rejilla y fractal. Diagrama de dispersión de GCNT frente a NCNT para las cuadrículas (rojo) y los fractales (azul).

Volviendo a la Fig. 5a yb, los valores más pequeños de GSi y los valores más grandes de GCNT para las cuadrículas en comparación con los fractales se combinan para generar la falta de diferencia significativa entre los dos parámetros en la Fig. 3a. Por el contrario, los valores más grandes de GSi y los valores más pequeños de GCNT en la Fig. 5a y b conducen a la diferencia significativa para los fractales que se ven en la Fig. 3c. Aunque NCNT es significativamente mayor que NSi tanto para las cuadrículas como para los fractales, la diferencia es mayor para las cuadrículas (Fig. 3b, d). Estas características también se pueden ver en la Fig. 4. Los datos fractales se encuentran más arriba de la línea negra que los datos de la cuadrícula en la Fig. 4a y lo contrario es cierto para la Fig. 4b. El aumento observado en NCNT con NSi en la Fig. 4b es consistente con la hipótesis anterior de grupos anclados a las paredes laterales de VACNT que median conexiones a través de procesos entre las neuronas en las cámaras y aquellas en las superficies de VACNT.

En términos del objetivo subyacente de acumular glía en las superficies de SiO2 y neuronas en las superficies VACNT, los electrodos fractales funcionaron mejor en las primeras y los electrodos de rejilla en las últimas. Sin embargo, se espera que la relativa falta de glía cercana para las neuronas en las superficies de rejilla VACNT tenga un impacto perjudicial en su supervivencia y actividad eléctrica a largo plazo. Aunque el objetivo del estudio actual era considerar las cámaras de rejilla en la escala de los cuerpos de células gliales individuales, es informativo considerar el impacto de aumentar el tamaño de la cámara. Si se fabricaran rejillas más grandes, podrían lograrse algunos efectos beneficiosos para la cobertura de la superficie glial. Sin embargo, aunque las cámaras más grandes podrían ofrecer una mayor libertad física para la cobertura glial debido a su geometría menos restringida, habría una reducción concomitante en la proximidad a las VACNT. Esto tendría múltiples impactos negativos: (1) las neuronas y la glía se benefician de las señales químicas83,84 entre sí y ambos tipos de células prosperan cuando están muy cerca. La implementación de rejillas con cámaras más grandes disminuirá esta proximidad entre la glía en el medio de las cámaras y las neuronas en las superficies VACNT, (2) la glía en el medio de las cámaras atraerá más neuronas lejos de las paredes laterales de VACNT. Esto aumenta la distancia entre las neuronas en el medio de la cámara y las ancladas en las paredes laterales (que median las conexiones entre las dos superficies), lo que podría reducir la NCNT, (3) para tamaños de cámara muy grandes, aumenta la probabilidad de tener áreas de brecha desprovistas de células59 lo que da como resultado una pérdida de espacio en el diseño de electrodos, (4) la densidad espacial reducida de VACNT proporcionará una superficie menos texturizada para apoyar y estimular las neuronas. La Fig. S5 complementaria compara el diseño fractal con cuadrículas que presentan una variedad de tamaños de cámara y calcula dos parámetros geométricos para explorar el equilibrio teórico entre la conectividad de la brecha y la proximidad de la brecha logrados por los dos diseños de electrodos. Los experimentos futuros deberían basarse en este modelado inicial para confirmar las propiedades favorables del fractal en una variedad de tamaños de cuadrícula.

Habiendo establecido una cobertura glial superior en los espacios para los electrodos fractales, ahora pasamos a discutir la cantidad de glia necesaria para mantener las neuronas sanas y funcionales en los electrodos VACNT. Para estudiar la correlación entre la glía dentro de los espacios de SiO2 y las neuronas en los electrodos VACNT, graficamos NCNT versus GSi en la Fig. 7. Considerando el diseño fractal, NCNT aumenta con GSi con el ajuste lineal mostrado descrito por un R2 de 0.63 . No estamos usando este ajuste para implicar un comportamiento estrictamente lineal, sino para resaltar las siguientes observaciones clave. En primer lugar, la tendencia de los datos sugiere que la ausencia de glía (es decir, GSi = 0) impide sustancialmente el crecimiento de los procesos neuronales. Sin embargo, los datos no revelan un límite inferior distinto (es decir, un valor GSi por debajo del cual NCNT cae a cero). Esto está respaldado por observaciones cualitativas que muestran que hay algunas regiones VACNT que soportan procesos incluso en ausencia de glía cercana. En segundo lugar, cuando las variaciones en GSi dentro del cultivo dan como resultado más glía, esta mayor presencia promueve el crecimiento neuronal. Mientras que es posible que aumentos adicionales en GSi eventualmente puedan causar que NCNT se sature o incluso muestre un agotamiento95,96, nuestro sistema fractal de 17 DIV opera dentro de un régimen en el que no hay límite superior: cuanto más glía, mejor. Al comparar las variaciones dentro del electrodo fractal, el crecimiento del proceso neuronal puede tomarse como un indicador de salud porque todos los demás factores geométricos son constantes. Hacemos hincapié en que esta suposición no se puede extender a las comparaciones entre las dos geometrías de electrodos. En particular, los valores NCNT más altos alcanzados por las rejillas en comparación con los fractales surgen de los factores geométricos discutidos anteriormente (es decir, las paredes laterales facilitan mayores conexiones a través de las regiones SiO2 y VACNT) junto con los valores GCNT más grandes de la rejilla. Para completar, incluimos el ajuste lineal para las cuadrículas, pero tenga en cuenta que los valores GSi significativamente más bajos de la cuadrícula excluyen observaciones significativas con respecto a la relación entre NCNT y GSi.

Estudio de la relación de NCNT con GSi para los electrodos de rejilla y fractal. Diagrama de dispersión de NCNT frente a GSi para las cuadrículas (rojo) y los fractales (azul). Las líneas sólidas rojas y azules se ajustan a cero para las cuadrículas y los fractales, respectivamente.

La discusión anterior se centra en las cantidades relativas de glía que son favorables para nuestro sistema en lugar de declarar valores absolutos para sistemas más amplios. Estudios previos destacan que las poblaciones de tipos de células y, en consecuencia, las proporciones de neuronas a glía pueden variar ampliamente entre las cepas de la misma especie de mamífero97 y entre subregiones de la misma estructura en función de la densidad neuronal9. Con la comprensión actual de la relación glía-neurona, es un desafío determinar un límite inferior o superior para la cantidad de glía necesaria en los espacios para garantizar la salud y la supervivencia de las neuronas en los electrodos VACNT. Estudios previos afirmaban que es necesaria una mínima ocupación glial para proteger a las neuronas de la muerte pero no cuantificaban el grado de ocupación necesaria95. También reconocemos que la cobertura glial y las disposiciones celulares reportadas en nuestro sistema in vitro son muy diferentes a la cobertura glial y las distribuciones celulares en un tejido nervioso gliótico afectado por condiciones neurodegenerativas15,81 o la inserción de un implante14,15. Una comprensión más profunda de la proporción apropiada de glía a neurona requiere experimentos futuros que utilizarían modelos in vivo de retinas degenerativas como la degeneración macular.

Finalmente, comparamos nuestras investigaciones actuales de la rejilla y los electrodos fractales con estudios previos de estas dos geometrías. Comenzando con rejillas, varias formaciones han aparecido en investigaciones gliales. El estudio de 1978 discutido anteriormente proporcionó una demostración inicial de que las cámaras de rejilla sin células gliales permanecieron así durante todo el experimento65, a pesar de las diferencias de altura insignificantes entre las cámaras de rejilla y las áreas recubiertas circundantes. Los electrodos de rejilla en nuestros estudios tienen paredes mucho más altas en comparación con el estudio de 1978. Esto enfatiza el papel restrictivo mejorado de las paredes de los electrodos en comparación con el papel restrictivo de las superficies adherentes y no adherentes. En cuanto a las dependencias del tamaño, los estudios han demostrado un aumento en la cobertura glial en función del aumento del área de superficie dentro de una matriz de cuadrícula que utiliza tamaños de cámara que oscilan entre 75 y 200 µm98. Para los patrones de cuadrícula definidos por trincheras64, el mayor espacio entre trincheras de 500 µm proporcionó la cobertura glial más alta. Estos hallazgos enfatizan la preferencia glial por geometrías con más grados de libertad espacial. Por ejemplo, se puede pensar que las trincheras son equivalentes a las brechas conectadas en nuestro estudio y, en consecuencia, la glía acumulada en ellas. Por lo tanto, estos hallazgos fueron consistentes con nuestra discusión sobre la libertad física que promueve la cobertura glial. Otros estudios investigaron la interacción de las neuronas con patrones de rejilla de alturas despreciables34,63. Estos mostraron que las neuronas siguieron los patrones y solo se desviaron de ellos en cultivos más largos. En el caso de nuestros estudios, la altura de los electrodos puede proporcionar potencialmente un confinamiento más sólido de las neuronas y sus procesos en la superficie del electrodo durante tiempos más prolongados. En otro estudio, se demostró que las neuronas del hipocampo y la glía se colocalizan en patrones de cuadrícula con alturas insignificantes en 26 cultivos DIV62. El objetivo de este estudio fue fundamentalmente diferente al nuestro, en el que apuntamos a guiar los dos tipos de células hacia diferentes regiones del electrodo mientras las mantenemos muy cerca unas de otras. Mientras que la mayoría de los estudios anteriores discutidos aquí se centraron en cultivos gliales o neuronales puros, investigamos un cocultivo de neuronas y glia para observar su comportamiento en condiciones más similares al tejido in vivo. Aunque conformados por un diseño de cuadrícula, estos estudios utilizaron enfoques químicos para guiar a las células a las áreas deseadas. Estos enfoques pueden no ser lo suficientemente estables para aplicaciones in vivo y son fundamentalmente diferentes a nuestro estudio actual en el que las brechas ofrecen el potencial para que las células amplíen su cobertura a través del crecimiento y la división celular.

De manera similar, la elección del diseño fractal como representante de una geometría 'abierta' se basa en una atención experimental previa59. Mientras que el estudio actual se centró en el aspecto 'abierto' versus 'cerrado' de la conexión de la brecha, en un estudio complementario reciente examinamos el carácter multiescalar de las brechas fractales y variamos los dos parámetros fractales centrales, D y m. El aumento de D redujo la velocidad a la que se expandieron los espacios, lo que dio lugar a espacios relativamente pequeños con altas coberturas gliales debido a su proximidad a los electrodos ricos en neuronas59. Aunque físicamente 'abiertos', todos los anchos de brecha en los fractales para el diseño m = 6 eran lo suficientemente estrechos para restringir la expansión celular. Por el contrario, la cobertura glial aumentó para m = 4 y 5 a los niveles revelados en el estudio actual debido a los valores más grandes de WSi-min que crean un sistema 'abierto'. Por lo tanto, se eligió el empleo de los parámetros D = 2, m = 5 en el estudio actual para garantizar un sistema 'abierto' para la comparación con la red 'cerrada'.

En este estudio, utilizamos la microscopía de fluorescencia para investigar el comportamiento fundamental de las neuronas de la retina de ratón y la glía cuando interactuaban con electrodos en un entorno in vitro durante 17 DIV. El estudio demostró la importancia de la geometría de los electrodos en combinación con las propiedades del material de los electrodos para controlar la respuesta glial y el comportamiento neuronal asociado. Al cultivar VACNT en un sustrato de SiO2, generamos regiones con patrones laterales de superficies texturizadas (VACNT) y lisas (SiO2). Sobre la base de estudios previos de las respuestas celulares a diferentes texturas superficiales, las regiones suaves de SiO2 se introdujeron en el diseño del electrodo para acumular predominantemente glía, mientras que el papel de las regiones VACNT texturizadas era acumular neuronas. Siguiendo esta estrategia, demostramos que un sistema "abierto" que consta de brechas de SiO2 conectadas con múltiples escalas en un diseño fractal fomenta la cobertura glial en comparación con un sistema "cerrado" que presenta una matriz de brechas desconectadas en una cuadrícula. Por el contrario, el electrodo de rejilla se desempeñó mejor en la acumulación de neuronas en las superficies VACNT, posiblemente debido a la proximidad de las neuronas a las paredes laterales VACNT. Sin embargo, se espera que la relativa falta de glía cercana para las neuronas en la rejilla VACNT tenga un impacto perjudicial en su supervivencia y actividad eléctrica95.

El estudio actual no pretendía ser una investigación exhaustiva de varias geometrías posibles, sino que tenía el objetivo de demostrar algunos comportamientos fundamentales para informar diseños futuros mediante la comparación de dos ejemplos. Nuestra elección de electrodos de rejilla y fractales como representantes de sistemas 'cerrados' y 'abiertos' se basa en estudios previos de estas geometrías en términos de aplicaciones y comportamiento celular fundamental. Según nuestras comparaciones experimentales, los futuros diseños de electrodos deben incluir un equilibrio cuidadoso entre la conexión y la proximidad de la brecha. Hemos presentado dos parámetros posibles para cuantificar estos efectos en la Información complementaria y hemos discutido cómo la conexión de los fractales combinada con una proximidad relativamente grande le da a las células mayores posibilidades de supervivencia en comparación con las cuadrículas.

En base a estos resultados, planteamos la hipótesis de que existe una combinación optimizada de material y geometría que maximizará las respuestas positivas de diferentes tipos de células dentro del tejido que interactúa con un electrodo. Como ejemplo, el patrón fractal actual se puede modificar mediante la eliminación de ramas o la rotación para eliminar las barreras en la región del espacio central del electrodo mientras se conecta el patrón a un rectángulo límite para mantener un electrodo continuo. Tales estrategias aumentan la conexión y accesibilidad de los espacios de SiO2 para la glía mientras mantienen su proximidad a las ramas VACNT aproximadamente igual (Figura complementaria S6a, b). En contraste con estas modificaciones positivas, la introducción de ramas adicionales en el diseño fractal para aumentar la proximidad puede tener consecuencias negativas, en particular, crear regiones cerradas de SiO2 que reducen la conectividad de la geometría (Fig. S6c complementaria). A largo plazo, esta optimización podría usarse para maximizar la eficiencia de los dispositivos implantables para el registro y la estimulación neuronal.

Aunque nuestro estudio demuestra la capacidad fundamental para controlar las distribuciones espaciales de la glía y las neuronas, los experimentos futuros deberán confirmar los beneficios en términos de salud de las neuronas y su estimulación eléctrica. Teniendo en cuenta las consecuencias para la salud, los electrodos fractales actuales operaron dentro de un régimen en el que la mayor presencia de glía cercana se correlacionó con un mayor crecimiento de los procesos neuronales en los electrodos, lo que apunta a un enfoque de "cuanta más glía, mejor" para la salud de las neuronas. Advertimos que no se espera que este régimen operativo sea universal y que es posible que sea necesario identificar y cuantificar los límites superiores de acumulación glial para algunos sistemas. En particular, aunque nuestros estudios in vitro representan un modelo controlado para el comportamiento in vivo, será necesario acomodar las diferencias entre estos entornos a largo plazo. Por ejemplo, los experimentos in vivo implicarán interacciones de electrodos con un tejido neural estructuralmente intacto tridimensional. La glía estará entonces presente en la capa del electrodo (es decir, acumulándose en los espacios entre los electrodos de 25 µm de altura) y en las capas retinales por encima del electrodo. En la práctica, notamos que el electrodo implantado interactuará con el tejido retiniano no saludable que ya muestra signos de gliosis reactiva y está remodelado en comparación con un tejido sano99,100. Por lo tanto, será necesario guiar el exceso de glía en el espacio tridimensional por encima del electrodo lejos de las superficies VACNT que sirven como interfaz neurona-electrodo. Guiar la glía hacia los espacios conectados del electrodo atraerá más neuronas a la superficie del electrodo99. Las contribuciones relativas a la salud de la glía en los espacios de los electrodos y las de la capa retiniana sobre el electrodo forman una pregunta interesante. Sin embargo, se espera que los futuros electrodos asuman un carácter más tridimensional utilizando VACNT de mayor relación de aspecto, lo que permitirá que el electrodo penetre más profundamente en el tejido neural y esté más cerca de las neuronas objetivo. La capa de interfaz desempeñará un papel cada vez más importante para estos futuros diseños de electrodos.

Teniendo en cuenta la estimulación eléctrica, estudios previos han demostrado el alto potencial de los CNT como sistema material. Tanto los CNT con patrón como sin patrón se han sesgado eléctricamente para estimular50,101, registrar51,102 e incluso aumentar la señalización eléctrica en las neuronas51,103. Sin embargo, estos estudios previos no investigaron el impacto de la disposición de las celdas. Los estudios futuros deberán investigar el grado en que las propiedades de estimulación favorables destacadas en los estudios anteriores pueden mejorarse mediante la disposición de las redes de células presentadas en nuestro estudio. Aquí, empleamos electrodos a gran escala para explorar la disposición holística de las células. Su traducción a implantes estimulantes del cerebro o de la retina necesitaría adaptarse a resoluciones más altas y aquí consideramos varios enfoques potenciales (Fig. S7 complementaria). La traducción más simple sería emplear el electrodo fractal como electrodo activo delimitado por un electrodo de tierra rectangular que presenta un espacio para permitir el paso del electrodo activo. Sin embargo, sería necesario reducir la escala del electrodo activo o subdividirlo en electrodos componentes para que coincida con los tamaños de los implantes cerebrales típicos. Un enfoque más atractivo, aplicable a los implantes de retina, utilizaría el fractal a gran escala como electrodo de tierra con una serie de pequeños agujeros definidos a lo largo de sus ramas. Luego, cada orificio encapsularía un electrodo cuadrado activo depositado en una capa de fotodiodo que está separada del electrodo de tierra por un aislante (ver referencias 56, 57 para simulaciones de esta operación de fotodiodo). La investigación futura se centrará en reemplazar los electrodos activos cuadrados con electrodos fractales para estimular potencialmente el crecimiento del proceso y también para aumentar su capacitancia eléctrica y, por lo tanto, su capacidad para estimular las neuronas57,58. En este enfoque, los espacios de SiO2 para acomodar la glía se obtendrían a expensas de no tener una matriz muy densa de electrodos activos. Sin embargo, garantizarán una interfaz neurona-electrodo más saludable. Si los principios generales mostrados en el estudio actual se extienden a los implantes in vivo, garantizarán que un gran número de neuronas residan dentro de los campos estimulantes de los electrodos y que su salud prolongada proporcionada por la glía cercana resulte en una estabilidad operativa.

Todos los datos y el código relacionado están disponibles en: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.20044022.

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Agradecemos a M. Pluth (Universidad de Oregón) por brindar la oportunidad y la capacitación para el sistema de imágenes de microscopía de fluorescencia. La instrumentación de microscopía fue apoyada por la NSF (CHE—1531189). También agradecemos a D. Miller y K. Zappitelli (Universidad de Oregon) por sus contribuciones a la construcción del sistema CVD y el desarrollo del proceso de síntesis VACNT.

RPT, CMN y BJA: Fundación WM Keck; Universidad de Oregon. RPT, WJW y MTP: Instituto Pufendorf. RPT: Fundación Legado Viviente; la Fundación Ciminelli; El Consejo de Investigación para el Avance de la Ciencia. MTP: El Consejo Sueco de Investigación—# 2016-03757; NanoLund en la Universidad de Lund; Stiftelsen för Synskadade i fd Malmöhus Län; el Comité para Ciegos de la Princesa Heredera Margareta; La Fundación Crafoord. BJA: Fundación Nacional de Ciencias -# DMR-1532225; Fideicomiso benéfico MJ Murdock.

Departamento de Física, 1371 Universidad de Oregon, Eugene, OR, 97403, EE. UU.

Saba Moslehi, Conor Rowland, Julian H. Smith, William J. Watterson, Benjamin J. German y Richard P. Taylor

Instituto de Ciencias de los Materiales, 1252 Universidad de Oregon, Eugene, OR, 97403, EE. UU.

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Departamento de Biología, 1210 Universidad de Oregon, Eugene, OR, 97403, EE. UU.

Willem Griffiths y Cristopher M. Niell

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Cristopher M. Niell

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División de Oftalmología, Departamento de Ciencias Clínicas Lund, Universidad de Lund, 221 84, Lund, Suecia

Maria-Thereza Perez

NanoLund, Universidad de Lund, 221 00, Lund, Suecia

Maria-Thereza Perez

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Todos los autores participaron en el diseño del estudio; SM, CR, JHS y WJW crearon los algoritmos de análisis neuronal y glial; SM, WJW y BJA ​​desarrollaron el proceso de síntesis VACNT; BJA concibió e implementó la plataforma VACNT; SM y CR fabricaron electrodos VACNT, MTP desarrolló los protocolos de cultivo celular e inmunocitoquímica; SM, CR y JHS realizaron cultivos de células retinales y microscopía de fluorescencia; SM, CR, JHS y WG realizaron procesamiento de imágenes, SM realizó análisis de datos estadísticos; SM, CR y RPT realizaron análisis y validación de datos; SM, CR y RPT diseñaron las figuras; SM, CR y RPT ayudaron a editar las cifras; SM y RPT redactó el manuscrito; RPT coordinó el proyecto; todos los autores editaron el manuscrito.

Correspondencia a Richard P. Taylor.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Moslehi, S., Rowland, C., Smith, JH et al. Comparación de electrodos fractales y de rejilla para estudiar los efectos del confinamiento espacial en el comportamiento glial y neuronal retiniano disociado. Informe científico 12, 17513 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21742-y

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Recibido: 10 junio 2022

Aceptado: 30 de septiembre de 2022

Publicado: 20 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21742-y

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