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Nov 03, 2023

El impacto de factores abióticos seleccionados en el proceso de eclosión de Artemia a través de

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 6370 (2023) Citar este artículo

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Los estudios actuales sobre los impactos abióticos en la Artemia, un crustáceo ampliamente utilizado en acuicultura y ecotoxicología, a menudo se centran en el análisis de puntos finales (p. ej., tasas de eclosión, supervivencia). Aquí, demostramos que se puede obtener una comprensión mecánica mediante la medición del consumo de oxígeno en tiempo real durante un período de tiempo prolongado en una plataforma de microfluidos. La plataforma permite un control de alto nivel del microambiente y la observación directa de los cambios morfológicos. Como demostración, la temperatura y la salinidad se eligen para representar parámetros abióticos críticos que también están amenazados por el cambio climático. El proceso de eclosión de Artemia consta de cuatro etapas diferentes: hidratación, diferenciación, emergencia y eclosión. Se ha demostrado que diferentes temperaturas (20, 35 y 30 °C) y salinidades (0, 25, 50 y 75 ppt) alteran significativamente la duración de las etapas de eclosión, las tasas metabólicas y la incubabilidad. Específicamente, la reanudación metabólica de los quistes de Artemia latentes mejoró significativamente a temperaturas más altas y salinidad moderada, sin embargo, el tiempo necesario para esta reanudación solo dependía de temperaturas más altas. La incubabilidad estuvo inversamente relacionada con la duración de la etapa de diferenciación de la eclosión, que persistió más tiempo a temperaturas y salinidades más bajas. El enfoque actual de investigación del metabolismo y los cambios físicos correspondientes se puede emplear para estudiar los procesos de eclosión de otras especies acuáticas, incluso aquellas con una tasa metabólica baja.

La creciente concentración de gases de efecto invernadero provocada por la actividad antrópica está modificando el clima global, y uno de los resultados inmediatos es el aumento de la temperatura ambiente1,2,3. Los océanos de todo el mundo, actuando como sumideros de calor, absorben la mayor parte de este calor4,5. La expansión térmica de los océanos como resultado del aumento del contenido de calor, así como el derretimiento de los glaciares, produce un aumento en el volumen del océano, lo que tiene un efecto directo en la salinidad del agua del océano6,7 que se ve agravado aún más por los cambios en el ciclo global del agua8,9 . Los efectos de las variaciones en estos parámetros sobre la reproducción y la salud pueden influir en la abundancia y distribución de diferentes especies acuáticas. Se han investigado los mecanismos precisos de acción de diferentes factores ambientales cambiantes, como factores abióticos10,11 y tóxicos ambientales12,13 sobre la respuesta fenotípica de diversas especies. Aquí, nuestro objetivo es obtener una comprensión mecánica de los impactos de los cambios en el entorno abiótico en el proceso de eclosión de Artemia, comúnmente conocida como camarones de salmuera, a través del monitoreo en tiempo real. La artemia es un alimento vivo popular utilizado en la acuicultura debido a su alta densidad nutricional, facilidad de cultivo y tamaño relativamente pequeño, lo que hace que esta especie sea óptima para facilitar la alimentación de larvas marinas con boca pequeña14,15. También se utiliza ampliamente como organismo modelo en estudios bioquímicos, fisiológicos, genéticos, ecológicos y ecotoxicológicos16,17,18. A pesar de que la Artemia vive en un ambiente hipersalino, que es su único mecanismo de defensa contra los depredadores19,20, la comprensión mecanicista de los efectos de los factores abióticos en el proceso de eclosión de la Artemia puede potencialmente proporcionar información sobre los efectos de alterar la temperatura y la salinidad en el eclosión de otros crustáceos muy extendidos en el medio marino, como los copépodos.

Las hembras de Artemia desarrollan un quiste de diapausa sin actividad metabólica detectable durante el modo de reproducción de oviparidad (diapausa endógena)21. En esta etapa latente, los quistes pueden deshidratarse mediante secado al aire o eliminación de agua osmótica, momento en el cual los quistes están inactivos y pueden sobrevivir hasta 28 años22. El metabolismo de los quistes se puede reanudar e iniciar la eclosión cuando las condiciones ambientales son favorables23, siendo los principales parámetros ambientales abióticos que afectan la incubabilidad la temperatura y la salinidad del agua17,24,25. Varios estudios previos han investigado el impacto de estos parámetros ambientales abióticos en la eclosión de Artemia26,27,28,29,30,31, sin embargo, la evaluación se limitó a la medición de la tasa de eclosión al final del experimento. Por ejemplo, Kumar et al. observaron que el rendimiento óptimo de eclosión de Artemia se produjo a 29 °C y 29 partes por mil (ppt) de salinidad26 mientras que Sharahi et al. encontró que las condiciones óptimas eran 27–28 °C y 35 ppt, respectivamente30. Hassan et al. mostraron que la proporción máxima de Artemia eclosionó cuando la salinidad y la temperatura fueron de 30 ppt y 24 °C, respectivamente, y que la tasa de eclosión disminuyó a medida que la temperatura aumentó de 24 a 32 °C mientras que la salinidad osciló entre 20 y 40 ppt27. Ahmed et al. informaron que la salinidad óptima para la incubabilidad es de 20 ppt31. En otro estudio realizado por Bahr et al. sobre la influencia de la salinidad en la eclosión, la incubabilidad óptima se encontró a salinidades de 60 ppt y temperaturas alrededor de 30 °C28. La variación en los parámetros óptimos podría deberse a diferencias en la configuración de la prueba (p. ej., exposición a la luz25,30,32) o variaciones en las condiciones ambientales (tamaño del recipiente, gradientes de temperatura/salinidad en medios a granel).

Este trabajo tiene como objetivo unificar las condiciones ambientales y ampliar la comprensión de los efectos de los parámetros abióticos más allá de la métrica de punto final de la tasa de eclosión a un análisis mecanicista profundo de sus impactos en el proceso de eclosión de Artemia. Las cuatro etapas distintas de eclosión de Artemia: (1) hidratación, (2) diferenciación, (3) emergencia y (4) eclosión33 se pueden diferenciar según los cambios morfológicos y el metabolismo34,35. En este estudio, hemos integrado un sensor óptico de oxígeno en un "acuario" de microfluidos para monitorear la tasa de consumo de oxígeno, también conocida como tasa metabólica de rutina36, en tiempo real durante todo el proceso de eclosión, mientras se emplea un microscopio óptico para capturar fotomicrografías de los quistes en eclosión a intervalos de tiempo regulares. Previamente se ha investigado el metabolismo de los quistes de Artemia37 y de otros pequeños crustáceos como Acartia tonsa38,39 y Leptodora kindti40 utilizando diferentes técnicas de respirometría. El tamaño relativamente pequeño de la plataforma de microfluidos utilizada en este estudio puede disminuir la relación señal-ruido41,42,43 del sensor de oxígeno y permitir la correlación de los datos del sensor con los datos de imágenes del microscopio. La plataforma también puede mantener más fácilmente condiciones ambientales uniformes44,45,46 utilizando controladores programables fuera del chip en comparación con los sistemas a granel (como vasos de precipitados, peceras) utilizados en estudios contemporáneos. Recientemente, las plataformas de microfluidos y milifluidos lab-on-a-chip se han utilizado para aplicaciones farmacéuticas que incluyen pruebas de drogas en células47, estudios biológicos en especies como C. elegans48,49,50,51,52 y pez cebra53,54,55. Además, en el presente trabajo, la precisión del análisis de punto final de la tasa de eclosión también se mejora a través de la transferencia automatizada, minimizando la contaminación y el error humano56,57,58,59, de toda la muestra analizada a un chip de conteo con tamiz. como estructuras de las que se pueden obtener imágenes en su totalidad y procesar con análisis de imágenes en lugar de depender de una muestra por lotes y métodos de conteo manual.

Los quistes de Artemia se compraron de Brine Shrimp Direct y se almacenaron a 4 °C según lo recomendado por el proveedor hasta un día antes de los estudios de eclosión, momento en el que se transfirieron a temperatura ambiente para permitir una adaptación gradual a la temperatura. La Figura 1A muestra imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) (JEOL FS-100) de los quistes de Artemia recibidos. Los quistes tienen una estructura en forma de copa, y el diámetro de la estructura circular de la copa oscila entre 180 y 260 µm.

Configuración experimental. (A) La microscopía electrónica de barrido (SEM) muestra la estructura en forma de copa de los quistes de Artemia recibidos con un aumento de 450X. (B) Resumen esquemático de la plataforma de microfluidos para estudiar el efecto de los parámetros ambientales abióticos en el rendimiento de eclosión de Artemia. (C) Chip de eclosión con sensor de O2 integrado y sondas de temperatura conectadas (barra de escala = 5 mm) (La posición del punto del sensor de O2 se muestra en el recuadro) (D) Chip de conteo con estructuras similares a tamices hechas de micropilares PDMS en la salida (escala barra = 10 mm) [Los quistes y nauplios atrapados en las estructuras de tamizado se muestran en el recuadro (barra de escala = 500 µm)].

Los estudios de eclosión de los quistes de Artemia se realizaron en una plataforma de microfluidos (Fig. 1B). La plataforma consistía en un chip de incubación, que tiene una cámara cilíndrica (diámetro de 13 mm, altura de 3,55 mm) conectada a una entrada y salida (altura de 1,7 mm, ancho de 4 mm) (Figura complementaria 1A). El volumen total del chip de incubación es ~ 563 μL. Se incorporaron esquinas redondeadas (filetes) en la entrada y la salida para garantizar que los quistes no quedaran atrapados en las esquinas de la cámara durante la inserción al comienzo de la eclosión y la transferencia de los quistes y nauplios al final del experimento. El volumen muerto se minimizó mediante la simulación del flujo de fluido en ANSYS FLUENT (Figura complementaria 1B). La Figura 1C muestra la cámara de eclosión utilizada para este estudio. El chip estaba compuesto de polidimetilsiloxano (PDMS) y se fabricó fundiendo PDMS en un molde (Fig. 1C complementaria) preparado con una impresora 3D (MAX X-43, Asiga) y curado durante la noche a 60 °C en un horno de convección por gravedad (modelo : 10GC, Quincy Lab). El chip de incubación tiene dos capas. La capa superior tiene las estructuras de la cámara y el canal, y la capa inferior es una losa de PDMS en blanco. Las capas superior e inferior del chip para incubar se unieron mediante un tratamiento corona (BD-20AC, ETP) y el posterior calentamiento a 60 °C durante la noche. Antes de unir las capas, se hicieron varios orificios en la capa superior utilizando punzones de biopsia para la entrada, la salida y los sensores. Se adhirió un punto de sensor de O2 (OXSP5, Pyroscience) a la capa superior del PDMS dentro de la cámara usando pegamento de silicona (Spglue, Pyroscience). Se conectó una fibra óptica exactamente detrás del punto del sensor de O2 a través de un orificio en el chip PDMS. La fibra óptica se conectó a un medidor de oxígeno óptico externo (FireSting®-O2, Pyroscience). El medidor de oxígeno estaba compuesto por un diodo emisor de luz (LED) y un fotodiodo que estimulan y detectan la emisión de luminiscencia dependiente del oxígeno del punto sensible al oxígeno y miden la concentración de oxígeno disuelto del agua en la cámara cada segundo durante la eclosión. También se conectó una sonda de temperatura (Pt100, Pyroscience) al chip para detectar la temperatura del agua dentro del chip y así compensar las lecturas de concentración de oxígeno disuelto ante cualquier fluctuación de temperatura. Para minimizar la variación, el chip se colocó encima de un calentador de película (calentador de película PI de 24 V, Icstation) conectado a un controlador proporcional-integral-derivativo (PID) (controlador de termostato electrónico de 6-30 V CC, DROK) que controlaba la temperatura del agua dentro del chip de incubación de acuerdo con la temperatura establecida (20, 25 y 30 °C). Se usó un adaptador de corriente CC de voltaje variable (ALP002, KEJIESHENG) para alimentar el controlador PID, y se le conectó una sonda de termopar (TC 10K, QINGDAO) para medir la temperatura del agua dentro del chip. El controlador PID ajusta la potencia de entrada de acuerdo con la medida de la sonda para mantener una variación máxima de 0,1 °C de la temperatura configurada. El chip de incubación con el calentador integrado se colocó bajo un microscopio óptico estereoscópico digital (SE400-Z, Amscope) equipado con una cámara digital (MD500, Amscope) para capturar una fotomicrografía del chip cada cinco minutos durante la eclosión. Durante todo el proceso de eclosión, se mantuvo encendida continuamente una luz de diodo emisor de luz (LED) (1W, Amscope) debido a su efecto sobre la eclosión26,32.

Antes del comienzo del experimento, el agua para la eclosión se preparó agregando cantidades variables de sal marina disponible comercialmente (Fluval Sea, pH: 8,1–8,2) al agua desionizada (DIW) (preparada y filtrada (tamaño de poro del filtro = 200 nm ) usando el sistema de purificación de agua Barnstead Smart2Pure, Thermo Scientific) para producir agua salada artificial con salinidades de 0, 25, 50 y 75 partes por mil (ppt) que se mezclaron en un tubo de ensayo usando un mezclador vórtex (Vortex genie 2, Scientific Industries) . La mezcla completa de la solución de agua salada permite una distribución uniforme del oxígeno disuelto y la sal. El peso de los quistes de Artemia se midió usando una balanza de precisión digital (Bonvoisin) y se mezcló cuidadosamente con la solución de agua salada para que la concentración de quistes fuera de 5 g/L. La solución de quistes se insertó inmediatamente dentro del chip de incubación hasta que se llenó la cámara. Luego, la entrada y la salida del chip se cerraron con tubos flexibles y clips de unión para evitar la infiltración de aire dentro del chip. Los experimentos de eclosión se realizaron durante 24 h desde el momento en que los quistes se sumergieron en las soluciones salinas. Los experimentos de eclosión se realizaron por triplicado para cada condición de temperatura (20, 25 y 30 °C) y salinidad (0, 25, 50 y 75 ppt).

Las diferentes etapas de eclosión de Artemia y la transición entre ellas se pueden identificar a través de cambios en el agotamiento de la concentración de oxígeno disuelto (DDOC) del agua en el chip de eclosión cerrado como resultado del consumo de oxígeno por parte de los quistes, medido por el on- sensor de oxígeno de chip y las fotomicrografías tomadas por el microscopio óptico. Esto proporciona información sobre el consumo de oxígeno y la duración de las distintas etapas de la eclosión. Los resultados del consumo de oxígeno se normalizan teniendo en cuenta la tasa de concentración de oxígeno (ROC) en cada etapa porque el valor absoluto y la duración de las distintas etapas de eclosión varían con la temperatura y la salinidad. ROC también se puede considerar como tasa metabólica estándar como se menciona en la literatura36. ROC se calculó utilizando la siguiente fórmula

En cada etapa de eclosión, se midió la duración y la ROC correspondiente, con la excepción de ciertas temperaturas y salinidades, en las que las etapas de emergencia y eclosión no se completaron en el período de eclosión de 24 h (Ver "Efecto de la salinidad y la temperatura del agua en la duración de las diferentes etapas de la eclosión").

La profundidad del chip de incubación (3,55 mm) se diseñó para garantizar que el líquido de suspensión tuviera suficiente oxígeno disuelto para la incubación y espacio para que nauplii nade. Esta profundidad permitió múltiples nauplios y quistes en el mismo plano vertical, lo que impidió el conteo preciso de nauplios y quistes. Por lo tanto, se diseñó un chip de conteo (Fig. 1D) con una cámara de poca profundidad (800 µm) de modo que los nauplios y los quistes se restringieron a una sola monocapa. El chip tenía una entrada y una salida. La salida contenía micropilares de PDMS que actuaban como estructuras similares a un tamiz (recuadro de la Fig. 1D) y permitían que solo el agua fluyera a través del canal, evitando que se escaparan los nauplios y los quistes en la cámara. El chip tenía dos capas: la capa superior tenía una cámara, estructuras de micropilares, entrada y salida, y estaba construida con PDMS fundido en un molde impreso en 3D (Fig. 2A complementaria). La capa inferior era una losa de PDMS en blanco. Ambas capas se unieron mediante tratamiento corona y posterior calentamiento, como se describió anteriormente. En la entrada y la salida del chip de conteo, la altura es mayor que la de la cámara (1,7 mm frente a 800 µm) y está diseñada con un radio de filete de 900 µm para permitir un flujo uniforme de quistes y nauplios de Artemia a través de la entrada y la salida . La Fig. 2B complementaria muestra los resultados de una simulación ANSYS Fluent del flujo de fluido a través del chip, lo que demuestra la ausencia de cualquier volumen muerto. Después de 24 h, los nauplios eclosionados y los quistes eclosionados/no eclosionados en el chip de eclosión se transfirieron automáticamente al chip de recuento en una solución de metanol al 30 % a un caudal de 100 µl/min mediante una bomba de jeringa (Pico plus 11 elite, Harvard Apparatus). La salida del chip de incubación y la entrada del chip de conteo se conectaron mediante un tubo de poli(tetrafluoroetileno) (PTFE), y la entrada del chip de incubación está conectada a la jeringa montada en la bomba de jeringa a través de un tubo Tygon flexible. Los nauplios de Artemia nadan rápidamente después de la eclosión y la solución de metanol al 30% en DIW se usó para sacrificar los nauplios para obtener imágenes claras en el chip de conteo. Se usó una cámara digital (D3100, Nikon) para capturar imágenes de los nauplios y quistes presentes en el chip de eclosión. Las imágenes se procesaron en ImageJ, donde se contó el número de quistes y nauplios en función de su circularidad. Si algún objeto tenía una circularidad mayor o igual a 0,9, se consideraba un quiste (con o sin tramar), y cualquier objeto en la imagen con una circularidad menor (menos de 0,9), se consideraba nauplio (Fig. 3). La tasa de eclosión se calculó utilizando la siguiente fórmula

Se utilizó OriginPro (ver. 2022b, OriginLab) para todos los análisis estadísticos. Los datos se representan como la media ± desviación estándar. Como se mencionó anteriormente en "Tasa de consumo de oxígeno y duración de las diferentes etapas", a ciertas temperaturas y salinidades, las etapas de emergencia y eclosión no se completaron dentro de las 24 h. Por lo tanto, para estas etapas, la importancia de los datos se determinó utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido de una prueba post-hoc de Bonferroni. Sin embargo, para las dos primeras etapas (hidratación y diferenciación) y la tasa de eclosión de punto final, los datos se obtuvieron a todas las temperaturas y salinidades, y la importancia de los datos dentro y entre los grupos se determinó mediante un ANOVA de dos vías con la prueba post-hoc de Bonferroni. . Las tablas de ANOVA se incluyen en la Tabla complementaria 1. Antes de realizar las pruebas de ANOVA, se examinó la normalidad de los datos mediante un gráfico cuantil-cuantil normal con un nivel de confianza del 95 %. El análisis de la correlación entre los diferentes resultados se realizó mediante el coeficiente de correlación de Pearson. Los datos se consideraron significativos en todos los análisis estadísticos si p < 0,05.

A medida que eclosionan los quistes de Artemia, su consumo de oxígeno y su morfología sufren cambios. Como se describe en la sección de métodos, estos cambios se registraron utilizando un sensor de oxígeno en el chip y un microscopio óptico. La Figura 2A muestra fotomicrografías de varias etapas de eclosión. La figura 2B muestra el agotamiento de la concentración de oxígeno disuelto (DDOC) del agua dentro del chip de incubación. Cuando había quistes dentro del chip de incubación, a medida que los quistes consumían oxígeno durante el proceso de incubación, la concentración de oxígeno disuelto en el agua disminuyó y, por lo tanto, aumentó el DDOC (línea continua azul). La tasa de consumo de oxígeno (ROC) en cada etapa, según lo estimado por Eq. (1), también se representa en la Fig. 2B (línea continua verde). Cuando el chip de eclosión contenía solo agua salada artificial pero no quistes (experimento de control), el DDOC (línea de puntos azul) y el ROC (línea de puntos verde) eran casi insignificantes. Es importante señalar que aunque el PDMS del material del chip de eclosión es permeable al oxígeno60,61, la comparación del DDOC con quistes dentro del chip con el DDOC sin quistes (control) indica que la tasa de consumo de oxígeno en todas las etapas es significativamente mayor que permeación apoyando así el uso de la presente configuración para comparar cualitativamente el DDOC en diferentes condiciones ambientales. Observamos que dado que los quistes de Artemia utilizados para la eclosión en este estudio no se esterilizaron, existe la posibilidad de que contengan microorganismos que consuman parte del oxígeno disuelto. Los efectos de los quistes y la posible presencia de microorganismos en el DDOC no se distinguieron en este estudio y se requiere más investigación. Sin embargo, como el experimento de control indica (líneas punteadas en la Fig. 2B) cambios insignificantes en DDOC durante el período de 24 h, se puede concluir que ni el chip de incubación ni los microorganismos potenciales en el agua salada artificial contribuyeron a cambios en el DDOC .

Fotomicrografías y lecturas de sensores de O2 en diferentes etapas de eclosión. (A) Fotomicrografía en diferentes etapas de eclosión obtenidas del estereomicroscopio óptico (barra de escala = 500 μm). El recuadro muestra la morfología de los quistes/nauplios en diferentes etapas (barra de escala = 100 µm). (B) Detección en el chip del agotamiento de la concentración de oxígeno disuelto (DDOC) cuando había quistes de Artemia (línea continua azul) y ningún quiste (línea discontinua azul de control) en el chip de eclosión a 25 °C y 25 ppt. La tasa de consumo de oxígeno (ROC) en diferentes etapas se representó mediante líneas verdes (línea continua, con quistes, línea punteada, control). Las líneas en negrita en el gráfico muestran el promedio y el área sombreada muestra la desviación estándar. Los triángulos rojos en (B) representan el DDOC en los puntos de tiempo correspondientes a las fotomicrografías presentadas en (A).

La inmersión de los quistes en agua inicia la etapa de hidratación, en la que los quistes se inflan y adquieren una forma esférica (en lugar de una copa) [Fig. 2A(i)]. A medida que los quistes absorben agua, el metabolismo energético, el ARN y la síntesis de proteínas comienzan en un período breve34,62. A medida que se reactiva el metabolismo energético, la actividad respiratoria aumenta drásticamente, como lo demuestra el aumento de la ROC (Fig. 2B). Al final de la etapa de hidratación, la mayoría de los quistes tienen forma esférica y comienza la diferenciación. Además, en esta etapa, no hay división celular ni aumento en el ADN34,62, lo que da como resultado un requerimiento de oxígeno bajo y casi constante y, por lo tanto, una ROC más baja (Fig. 2B). En la tercera etapa (emergencia), la cubierta del quiste comienza a fracturarse debido al aumento de la presión de turgencia que resulta de una mayor cantidad de glicerol, y el embrión comienza a emerger de la cubierta rota dentro de una membrana de eclosión [Fig. 2A(iii)]35. La etapa de emergencia es muy activa y necesita energía adicional, lo que resulta en un aumento de DDOC y ROC (Fig. 2B). Finalmente, en la última etapa (eclosión), los embriones de Artemia abandonan la cubierta del quiste y la membrana de eclosión y comienzan a nadar [Fig. 2A(iv)]. En esta etapa, la demanda de oxígeno volvió a bajar, como se detectó por una disminución comparativa en ROC (Fig. 2B).

La duración de cada etapa de eclosión a varias temperaturas y salinidades se presenta en la Fig. 3. En general, notamos que a la temperatura más baja (20 °C) y/o salinidad más baja (0 ppt) en nuestro rango probado, el 24- h período de tiempo fue insuficiente para completar la eclosión debido a la duración prolongada de cada una de las primeras tres etapas, con la excepción de 20 °C a 25 ppt y 0 ppt a 30 °C. En línea con esto, se encontró que la duración de la etapa de eclosión (definida como el tiempo restante al final de la etapa de emergencia) disminuyó considerablemente cuando la salinidad aumentó a 75 ppt a 25 y 30 °C. A 20 °C (donde la etapa de eclosión se observó a solo 25 ppt de salinidad), la duración de la etapa de eclosión se redujo significativamente en comparación con todas las demás temperaturas estudiadas, independientemente de la salinidad.

Duración de las diferentes etapas de eclosión a diferentes salinidades y temperaturas del agua. Los valores se expresan como media ± desviación estándar (n = 3). En cada categoría (hidratación y duración de la etapa de diferenciación), los medios que no comparten la misma letra son significativamente diferentes entre sí (ANOVA de dos vías con prueba post-hoc de Bonferroni, p < 0,05). Las etapas de eclosión que no se completaron dentro de las 24 h no se analizaron estadísticamente y se marcaron con "nc". * y # denotan una duración significativamente diferente de la etapa de emergencia y eclosión, respectivamente, a una temperatura en comparación con las otras temperaturas probadas (ANOVA unidireccional con prueba post-hoc de Bonferroni, p < 0,05). ** denota una duración de la etapa de eclosión significativamente diferente entre dos salinidades diferentes probadas (ANOVA unidireccional con prueba post-hoc de Bonferroni, p < 0,05).

Reconociendo que durante la hidratación (barras verdes, Fig. 3), los quistes secos de Artemia absorben agua por ósmosis63, el efecto de la temperatura y la salinidad puede modelarse mediante la ley de Van't Hoff64

donde Δπ es la diferencia en la presión osmótica, R es la constante universal de los gases, T es la temperatura y ΔC es la diferencia en las concentraciones de soluto. A medida que aumenta la temperatura (T), también lo hace la tasa de ósmosis, lo que corresponde a una disminución en la duración de la hidratación, como se ilustra en la Fig. 3. La Fig. 4A complementaria muestra la correlación negativa significativa entre la duración de la hidratación y la temperatura determinada por la correlación de Pearson. coeficiente (r = - 0.9) y un ajuste lineal entre estos parámetros (R2 = 0.99) (Fig. 4B complementaria). Al mismo tiempo, el aumento de la salinidad del agua a cualquier temperatura puede disminuir la diferencia en las concentraciones de soluto internas y externas (ΔC) de los quistes, lo que debería disminuir la presión osmótica con un aumento en la duración de la hidratación. Sin embargo, los resultados experimentales indican que los cambios en la salinidad no afectaron significativamente la duración de la hidratación. En contraste, la duración de la diferenciación (barras azules, Fig. 3) disminuyó significativamente cuando se incrementó la temperatura o la salinidad de 0 a 25 ppt (no varía significativamente más allá de 25 ppt) a cualquier temperatura, excepto 30 °C. Para entender esto, notemos que a través de la etapa de diferenciación, el quiste llega a la etapa de emergencia, cuando la creciente presión de turgencia inducida por la síntesis de glicerol a partir de trehalosa hace que la cubierta comience a fracturarse. Un aumento de la temperatura mejora la síntesis de glicerol63, lo que a su vez acorta el período de diferenciación. El aumento de la salinidad también aumenta el nivel de glicerol35 y puede disminuir el período de diferenciación. Sin embargo, a medida que aumenta la salinidad del agua, el entorno externo se vuelve hipertónico y existe la posibilidad de pérdida de agua celular debido al proceso de exosmosis, lo que podría alargar el período de diferenciación a mayor salinidad. La competencia entre estos dos factores opuestos podría explicar por qué no hubo una diferencia significativa en la duración de la etapa de diferenciación más allá de 25 ppt de salinidad. Curiosamente, la duración de la etapa de emergencia (barras naranjas, Fig. 3) sugiere una temperatura óptima de 25 °C con una disminución significativa en la duración, en comparación con la de 20 y 30 °C. Aunque la temperatura ayuda a aumentar la presión osmótica y, por lo tanto, reduce la duración de la etapa de hidratación y diferenciación, una vez que comienza la etapa de emergencia y el embrión emerge dentro de la membrana de eclosión, parece tener menos tolerancia a temperaturas más altas. Por lo tanto, una temperatura intermedia de 25 °C fue más favorable para la etapa de emergencia y requirió menos tiempo para completarse.

Se obtiene una mayor comprensión del proceso de incubación examinando directamente el agotamiento de la concentración de oxígeno disuelto (DDOC) del agua en la cámara de incubación para diferentes temperaturas y salinidades. La Fig. 5 complementaria muestra las curvas DDOC promedio de experimentos por triplicado realizados en cada condición de temperatura y salinidad. En general, los resultados indican una correlación positiva entre la duración de la eclosión y el DDOC para salinidades superiores a cero.

El DDOC total, o consumo total de oxígeno, para el período de eclosión de 24 h se muestra en la Fig. 4A, lo que indica la presencia de una temperatura óptima (25 °C), porque el consumo total de oxígeno es mayor a esta temperatura independientemente de la salinidad. El consumo total de oxígeno disminuyó significativamente a medida que la temperatura aumentó de 20 a 30 °C, independientemente de la salinidad. La salinidad redujo significativamente el consumo total de oxígeno solo cuando se incrementó de 25 a 75 ppt, independientemente de la temperatura; sin embargo, no hubo cambios significativos cuando se alteró la salinidad a 30 °C, lo que sugiere una interacción significativa entre la temperatura y la salinidad. Según el peso de los quistes secos iniciales utilizados, este consumo total de oxígeno varió de 5,81 × 10–7 a 3,47 × 10–5 mg O2/h/mg de peso seco, con temperatura y salinidad variables, que es comparable al consumo de oxígeno de Artemia37, y otros huevos de crustáceos, como Anomalocera patersoni65 y Pontella mediterranea66 informados en estudios anteriores.

Consumo de oxígeno de los quistes de Artemia a diferentes temperaturas y salinidades. (A) Consumo total de oxígeno, o DDOC total a lo largo de todo el proceso de eclosión bajo diferentes temperaturas y salinidades. (B) Tasa de consumo de oxígeno (ROC) en diferentes etapas de eclosión: (i) hidratación, (ii) diferenciación, (iii) emergencia y (iv) etapa de eclosión. Los valores se expresan como media ± desviación estándar (n = 3). En cada categoría de datos (consumo de oxígeno total, o ROC en etapas de hidratación y diferenciación), las medias que no comparten letras arriba de las columnas son sustancialmente diferentes entre sí (ANOVA de dos vías con prueba post-hoc de Bonferroni, p < 0,05) . A diferentes temperaturas probadas, ROC estadísticamente significativo fue indicado por * (ANOVA de dos vías con prueba post-hoc de Bonferroni, p < 0.05) y ** (ANOVA de una vía con prueba post-hoc de Bonferroni, p < 0.05) respectivamente, mientras que # indica un consumo total de oxígeno estadísticamente significativo (ANOVA de dos vías con prueba post-hoc de Bonferroni, p < 0,05).

Se obtiene una comprensión más detallada de los efectos de la temperatura y la salinidad en el proceso de eclosión considerando el consumo de oxígeno en cada una de las cuatro etapas de la eclosión. Independientemente de la salinidad, la ROC aumentó significativamente durante la hidratación cuando la temperatura aumentó de 20 °C [Fig. 4B(i)]. La ROC también disminuyó significativamente con el aumento de la salinidad entre 25 y 75 ppt, lo que refleja una menor actividad de acuerdo con la mayor duración (Fig. 3). Por otro lado, aunque tanto la salinidad como la temperatura disminuyeron la duración de la diferenciación, la tasa metabólica no se vio afectada significativamente [Fig. 4B(ii)]. Durante la etapa de emergencia, se encontró que la ROC se vio significativamente afectada por la temperatura, pero no por la salinidad a un nivel de p = 0,05 (ANOVA de una vía), y la ROC disminuyó significativamente cuando la temperatura aumentó de 25 a 30 °C (Bonferroni, p < 0,05, figura 4B(iii)). Observamos que la significación estadística de los datos se evaluó mediante ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de Bonferroni debido a la emergencia incompleta en algunas condiciones experimentales (Fig. 3). La disminución del consumo de oxígeno con el aumento de la temperatura puede indicar estrés fisiológico. Finalmente, en la etapa de eclosión, la ROC disminuyó en comparación con la etapa de emergencia, y fue máxima a 25 °C independientemente de la salinidad, y la salinidad no tiene efecto sobre la ROC en esta etapa. Se observó un aumento similar en la demanda de energía durante la emergencia y una disminución después de la eclosión en otras especies de crustáceos, como Acartia tonsa67, Cherax quadricarinatus68 y Cancer pagurus69. En nuestro estudio, el consumo de oxígeno por unidad de peso seco de los quistes de Artemia en etapa de emergencia osciló entre 7,98 × 10–7 y 2,5 × 10–5 mg O2/h/mg de peso seco con temperaturas y salinidades variables. Según el límite superior, el consumo de oxígeno durante la aparición del quiste de Artemia es aproximadamente 5,54 veces menor que el del crustáceo grande Cancer pagurus69 y 0,43 veces mayor que el del crustáceo pequeño Pontella mediterranea66. Además, se observó una ROC negativa en la etapa de eclosión bajo ciertas condiciones de temperatura y salinidad. Con una salinidad de 25 ppt a 20 °C y 30 °C, esto podría deberse al muy bajo consumo de oxígeno de la Artemia incubada y a la posible permeación de una cantidad muy baja de oxígeno a través de PDMS (ver Fig. 2B-experimento de control). Sin embargo, a 0 ppt/30 °C, se observó que todos los nauplios morían después de la eclosión (sin movilidad) posiblemente debido al efecto combinado de salinidad cero y temperatura alta, y por razones desconocidas, la concentración de oxígeno del agua aumentó durante esta vez. Una posible explicación podría ser que, durante el proceso de eclosión, se observó que algunos quistes liberaban burbujas de aire que inicialmente podrían haber quedado atrapadas dentro de la cubierta del quiste. Los nauplios vivos consumirían este oxígeno extra de las burbujas de aire; pero, en este caso, debido a que no había presentes nauplios vivos, el contenido de oxígeno del agua de eclosión aumentó ligeramente. Sin embargo, se desconoce la razón exacta de este aumento en el contenido de oxígeno y requiere más investigación.

La Figura 5 ilustra la tasa de eclosión (estimada utilizando la ecuación (2)) de los quistes de Artemia en nuestra plataforma a diferentes temperaturas y salinidades. De acuerdo con trabajos previos, los resultados indican la existencia de condiciones óptimas27,30. Específicamente, la tasa de eclosión aumentó drásticamente cuando la temperatura aumentó de 20 a 25 °C, pero no hubo cambios significativos a medida que la temperatura aumentaba más. De manera similar, la tasa de eclosión aumentó cuando la salinidad aumentó de 0 a 25 ppt a 20 y 25 °C, y de 0 a 50 ppt a 30 °C, pero posteriormente se redujo con el aumento de la salinidad. Se observó una tasa máxima de eclosión a una temperatura de 25 °C y una salinidad del agua de 25 ppt (76,85 ± 14,22 %) de acuerdo con la ROC máxima medida [Fig. 4(iv)]. Además, el ROC medido indicó que las tasas de eclosión muy bajas a salinidad cero y 20 °C no reflejan necesariamente condiciones hostiles (ya que observamos actividad), pero que la duración de 24 horas es insuficiente.

Cálculo de la tasa de eclosión en chip de Artemia a diferentes salinidades y temperaturas del agua. Los valores se expresan como media ± desviación estándar (n = 3). Las medias que no comparten la misma letra arriba de las columnas son sustancialmente diferentes entre sí (ANOVA de dos vías con Bonferroni, p < 0,05).

El presente enfoque, en el que todo el proceso de eclosión se monitorea en tiempo real, mejora de manera única la comprensión de las relaciones entre los parámetros abióticos, las características de la etapa (duración, ROC) y la tasa de eclosión. Para cuantificar estos parámetros, implementamos una correlación de Pearson. En primer lugar, notamos que aunque la ROC se vio significativamente afectada por la temperatura, la salinidad o ambas, solo la ROC en la etapa de eclosión tuvo una asociación estadísticamente significativa (correlación positiva) con la tasa de eclosión. Por otro lado, solo la duración de la diferenciación se correlaciona significativamente con la tasa de eclosión (correlación negativa).

Se observaron correlaciones negativas entre la tasa de eclosión e hidratación y la duración de la etapa de diferenciación y una correlación positiva entre la tasa de eclosión y la duración de la etapa de eclosión. La tasa de eclosión fue máxima cuando la temperatura y la salinidad fueron de 25 °C y 25 ppt, respectivamente. A menor o mayor temperatura o salinidad entre las condiciones probadas, la etapa de hidratación y diferenciación tomó más tiempo, y la etapa de eclosión fue más corta. De manera similar, el consumo de oxígeno se correlaciona positivamente con la tasa de eclosión en la etapa de hidratación y eclosión, pero negativamente con la tasa de eclosión en la etapa de diferenciación. A una temperatura de 25 °C y una salinidad de 25 ppt, el consumo de oxígeno fue comparativamente alto en la etapa de hidratación, menor durante la etapa de diferenciación y muy alto en la etapa de eclosión. Este patrón se invirtió a temperaturas o salinidades probadas muy bajas o muy altas. Estos hallazgos muestran que la temperatura y la salinidad afectan significativamente todo el proceso de eclosión. La incubabilidad más alta se obtiene en esa condición favorable de temperatura y salinidad, cuando la mayoría de los quistes se hidratan y recuperan una tasa metabólica más alta en un período de tiempo más corto durante la etapa de hidratación, gastan menos energía durante la etapa de diferenciación y la completan más rápidamente. En esta condición óptima, los quistes pasarán más tiempo en la etapa de eclosión, lo que resultará en una mayor cantidad de quistes eclosionados y un mayor consumo de oxígeno.

En este trabajo, hemos demostrado que la medición de las tasas metabólicas en tiempo real y los cambios morfológicos correspondientes pueden ofrecer una comprensión mecanicista profunda de cómo los parámetros abióticos afectan el proceso de eclosión de Artemia. Centrándonos en la temperatura y la salinidad (dos parámetros ambientales significativos que también son susceptibles al cambio climático), medimos el comportamiento de la respiración, la progresión de la eclosión y el número resultante de Artemia incubada bajo distintos niveles de temperatura y salinidad durante un período de tiempo predeterminado. Aunque los hábitats de Artemia están limitados por la hipersalinidad, este estudio puede arrojar luz sobre los posibles impactos de la temperatura y la salinidad en el proceso de eclosión de otras especies de crustáceos más extendidas.

De acuerdo con estudios previos, se observa que salinidades extremas (bajas o altas) y bajas temperaturas inhiben la eclosión de Artemia, verificando la existencia de condiciones óptimas de eclosión26,27,28,29,30,31. Sin embargo, aunque estos estudios anteriores se centran principalmente en las mediciones de punto final de la tasa de eclosión, aquí hemos establecido relaciones entre la tasa de eclosión y la progresión del comportamiento de eclosión y respiración a lo largo del proceso. Por ejemplo, demostramos que un factor clave que afecta la incubabilidad de Artemia en un período de tiempo de 24 h es la duración de la etapa de diferenciación, que resulta ser inversamente proporcional a la tasa de eclosión. En general, la duración de la diferenciación (barras azules, Fig. 3) disminuye con el aumento de la salinidad y la temperatura, excepto a salinidades muy altas. Con base en la comprensión de la etapa de diferenciación, es posible que esta relación esté relacionada con una mayor producción de glicerol que acelera la fractura de la cubierta que caracteriza el inicio de la emergencia. Aunque la validación de esta hipótesis se deja para trabajos futuros, ilustramos que los experimentos actuales resaltan áreas clave de enfoque para comprender la compleja relación entre el medio ambiente y la salud de los animales acuáticos. También se demostró claramente un vínculo crucial entre la temperatura, la salinidad y la reactivación del metabolismo del quiste inactivo al comparar la progresión de la hidratación con la ley de Van't Hoff.

El presente enfoque experimental fue posible gracias al desarrollo de una plataforma microfluídica novedosa con sensor de oxígeno integrado, en la que también se podían registrar los cambios físicos en los quistes de Artemia mediante un microscopio óptico. Se obtiene un control ambiental preciso utilizando un calentador con un circuito de retroalimentación y un chip de conteo automatizado diseñado para eliminar los errores asociados con la falta de un control ambiental estricto y el cálculo manual de la incubabilidad. Además de ofrecer una visión más profunda de los procesos biológicos, el uso generalizado de sistemas automatizados con control ambiental preciso estandariza los experimentos, lo que da como resultado una comparación cruzada más informativa en la literatura. Por lo tanto, se anticipa que el presente enfoque tendrá una aplicabilidad más amplia en la investigación de zooplancton y larvas de peces, incluso bajo diversas condiciones ambientales abióticas/bióticas y contaminantes acuáticos.

Los conjuntos de datos están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Este trabajo cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias (número de premio: 2038484, año: 2020). Los gráficos se trazaron utilizando OriginPro 2022b (https://www.originlab.com/). Los esquemas se crearon utilizando Biorender (https://biorender.com/).

Departamento de Ingeniería Mecánica y de Materiales, Universidad Internacional de Florida, 10555 W Flagler St, Miami, FL, 33174, EE. UU.

Preyojon Dey & Alicia Boymelgreen

Departamento de Pesca, Ciencia Animal y Veterinaria, Universidad de Rhode Island, Kingston, RI, 02881, EE. UU.

Terence M Bradley

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DP: conceptualización, metodología, investigación, análisis formal, visualización, redacción—borrador original. TB: conceptualización, supervisión, análisis formal, redacción—revisión y edición, adquisición de fondos. AB: conceptualización, supervisión, análisis formal, redacción—revisión y edición, adquisición de fondos.

Correspondencia a Alicia Boymelgreen.

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Reimpresiones y permisos

Dey, P., Bradley, TM y Boymelgreen, A. El impacto de factores abióticos seleccionados en el proceso de eclosión de Artemia a través de la observación en tiempo real de los cambios de oxígeno en una plataforma de microfluidos. Informe científico 13, 6370 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32873-1

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Recibido: 24 enero 2023

Aceptado: 04 abril 2023

Publicado: 19 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32873-1

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